[发明专利]一种酶合成胸腺五肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于多肽激素制备技术领域，特别涉及一种酶合成胸腺五肽的方法。

背景技术

胸腺肽是动物胸腺产生的一种多肽激素，在我国临床应用已有20多年的历史，普通胸腺肽属于生化制品，是健康小牛或猪等动物的胸腺组织提取物。该药是一种生物反应调节因子，能促进淋巴细胞成熟，调节和增强人体免疫机制，在临床上具有抗衰老、抗病毒复制、抗肿瘤细胞分化的作用。由于胸腺肽有效成分不明确、含量低、含致敏大分子蛋白，不符合WHO对免疫调节剂的五项标准（化学成分明确；易于降解；刺激适中；不致癌，致畸变；无累积毒性，无不良反应及后继作用），因而疗效低、安全性差，不良反应尤其是严重过敏反应频繁发生，由此引发了国家药品不良反应监测中心对该类药品进行通报。使用胸腺肽制剂曾出现过敏性休克、皮疹、发热、寒战、畏寒，胸闷、心悸、呼吸困难、头痛、紫绀等多项不良反应，使用前需做皮内敏感试验，在皮试阴性时，仍需加强临床用药监护。

胸腺五肽是人工合成的五肽，其氨基酸序列为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr（精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸），取自胸腺肽的第32-36位氨基酸，为胸腺肽的主要活性部位，与胸腺肽有着相同的生理功能和药效，其特点是药物纯度高、含量稳定、安全可靠，且不含有大分子蛋白质，在临床推广过程中，胸腺五肽由于纯度高、质量稳定、疗效确切、安全可靠而受到广大医患的欢迎，使用前无需皮试。胸腺五肽是具有良好药效的五肽类药物，开发成熟、成本较低的合成胸腺五肽方法，具有重要的社会意义和巨大的市场前景。

国内生产胸腺五肽这样高端产品的企业只有几家，而且都是应用化学方法合成的。化学方法合成的缺点表现在反应条件剧烈，合成中存在产物消旋化的问题，需要对侧链基团进行保护，有副反应，产品难于回收，易造成化学污染，工艺复杂，成本高，生产效率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种酶合成胸腺五肽的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种酶合成胸腺五肽的方法，包括如下步骤：

（1）叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯（Boc-Val-Tyr-OMe）二肽的合成：将0.2～0.8mol/L pH5.0～8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比4～10：40～55：20～35依次加入木瓜蛋白酶（papain，PA）、叔丁氧羰基-缬氨酸（Boc-Val）和酪氨酸-甲酯（Tyr-OMe），于30～60℃反应12～48h，得到叔丁氧羰基-缬氨酸-酪氨酸-甲酯二肽；

（2）[叔丁氧羰基-精氨酸（2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）-赖氨酸-甲酯]（Boc-Arg(pbf)-Lys-Ome）二肽的合成：将0.6～1.2mol/L pH4.0～7.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比4～10：45～55：40～55依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸(2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)]（Boc-Arg(pbf)）和赖氨酸-甲酯（Lys-OMe），于30～60℃反应36～72h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸（2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）-赖氨酸-甲酯]二肽；

（3）[叔丁氧羰基-精氨酸（2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]（Boc-Arg(pbf)-Lys-Asp-OMe）三肽的合成：将0.2～0.8mol/L pH5.0～8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液加入乙酸乙酯中，搅拌均匀，然后按质量比3～10：2～7：4～10依次加入木瓜蛋白酶、[叔丁氧羰基-精氨酸（2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）-赖氨酸]（Boc-Arg(pbf)-Lys）和天冬氨酸-甲酯（Asp-OMe），于30～60℃反应36～72h，得到[叔丁氧羰基-精氨酸（2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基）-赖氨酸-天冬氨酸-甲酯]三肽；