[发明专利]一种脂肪细胞中自噬的监测方法有效
| 申请号： | 201310023764.8 | 申请日： | 2013-01-22 |
| 公开（公告）号： | CN103060421A | 公开（公告）日： | 2013-04-24 |
| 发明（设计）人： | 宁光;邓玉杰;杨颖;张志国 | 申请（专利权）人： | 上海市内分泌代谢病研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/02 | 分类号： | C12Q1/02;C12N15/867;G01N33/68 |
| 代理公司： | 上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227 | 代理人： | 吴瑾瑜 |
| 地址： | 200025 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 脂肪 细胞 监测 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种脂肪细胞中自噬的监测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养及诱导分化3T3-L1前脂肪细胞获得成熟的脂肪细胞，用0.2%BSA-DMEM孵育12h，裂解所获得的脂肪细胞，抽提其蛋白质；
（2）采用BCA法对蛋白质进行定量，计算所获得的蛋白质样品的浓度，然后进行蛋白免疫印迹分析；
（3）以小鼠的肝脏cDNA为模板，根据Genebank的小鼠LC3b基因编码区设计引物，根据载体质粒上的多克隆位点选择LC3编码区不含有的酶切位点加入到引物的上下游，上游引物的序列为：CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位点为XhoⅠ；下游引物的序列为CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位点为BamHⅠ；PCR产物割胶回收，扩增出LC3b DNA片段，取双酶切后的的LC3片段和的pLVX-IRES-ZsGreen1进行T4DNA连接酶连接，培养产物，提取质粒，取酶切验证后的质粒进行测序分析；
（4）用PlVX-LC3-IRES-ZsGreen1质粒，delta8.9质粒和VSVG转染293T细胞，收集病毒上清，进行慢病毒滴度的测定；
（5）病毒转染成熟3T3-L1脂肪细胞，共聚焦显微镜观察及电镜观察自噬体。
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