[发明专利]一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型蛋白酶谱的电泳检测方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

蛋白酶（proteases,proteinases）也称为肽酶（peptidases），是一类能水解蛋白质和多肽水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，执行许多不同的生理功能。根据不同的标准可以将蛋白酶分成很多种。根据水解肽键的方式，可细分为内肽酶、外肽酶、转肽酶等。根据最适pH，可以将蛋白酶分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。MEROPS数据库记录了蛋白酶及蛋白酶的肽类抑制剂的相关信息，根据催化中心参与催化的氨基酸的不同，在该数据库中蛋白酶可分成6大类：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和未知催化类型的蛋白酶。蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，占了世界酶类销售总额的60%，在食品、医药、纺织、制革、洗涤剂、化妆品、动植物蛋白以及废物处理等行业都有着很好的应用前景。

酶谱分析是一种电泳技术，是在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的基础上发展而来的，它在聚丙烯酰胺凝胶中添加了底物分子，从而可以检测酶活性。虽然存在许多不同类型的酶谱分析（根据酶的类型），其中使用最频繁的检测蛋白酶活性的是明胶酶谱分析。上样缓冲液配方与标准的SDS-PAGE上样缓冲液基本相同，但是不含还原剂[2-mercaptoetanol，二硫苏糖醇（DTT）]，也不加热。电泳结束后，将SDS凝胶在Triton X-100中洗3次，然后将其孵育于一个适当的反应缓冲液中，使酶和底物发生反应，随后SDS凝胶进行考马斯亮蓝染色，被酶降解的区域会有明显的条带显示。经过五十多年的发展，酶谱法也衍生出很多新的技术，具体有：（1）常规方法，一维酶谱电泳胶中添加蛋白酶底物与胶共聚合。电泳结束后，酶进行胶内复性，降解胶中的底物，此时在胶的蓝色背景下会出现白色透明水解条带。（2）二维酶谱电泳的原理同一维酶谱电泳，但样品事先要经过等电聚焦（IEF）初步分离，酶降解底物后胶上会有白色水解圈。（3）二维电泳结束后得到的水解圈，可通过MALDI-TOF/MS鉴定蛋白酶。（4）组织样品可直接进行胶内酶解（In-situ zymography，ISZ)，这样就可根据酶活对细胞定位。（5）实时定量酶谱法（Real-time zymography，RTZ)可对酶活的变化定时监测。（6）多层次底物酶谱法（Multiple layer substrate zymography，MLSZ)可以利用一块胶来检测不同的酶。具体方法是样品经电泳分离后再用电转的方法将胶里的蛋白转移到含不同底物的胶上。这就实现了一次电泳，多次检测的效果。（7）反向酶谱法（Reverse zymography），与其他酶谱法的胶内添加底物不同，这种方法是将酶加入胶中，然后检测酶的抑制剂。有抑制作用的会在亮的背景里出现黑色条带。

其中底物胶方法虽然常被用来检测蛋白水解酶类的活性酶谱，但有些蛋白酶在含有底物的胶中的迁移率会受到严重影响，所以导致蛋白酶条带很难分开或是难以确定其分子量。为了解决这一问题，有些研究者就将此方法进行了改良，首先将蛋白酶样品首先进行不含底物的非变性的SDS-PAGE电泳，在通过电转将跑好的条带转移到事先准备好的含有底物蛋白的另一张凝胶上，反应一段时间后，第二张含有底物的授予胶去染色，脱色，会在相应的位置产生透明的条带。虽然该方法在一定程度上解决了底物对蛋白酶迁移率受到阻碍的问题，但是要求必须有电转装置，而且增加了操作步骤，在电转过程中还可能造成蛋白酶的失活。本发明针对上述问题进行了改良，通过底物浸泡方法解决了上述传统方法可能的造成的误差，可有效应用于蛋白酶谱分析。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种更为快速准确地检测蛋白酶谱的新方法，应用该方法，可以减少传统底物胶方法蛋白条带堆积，分子量偏差，以及使用昂贵仪器的缺点，实现对多种蛋白酶谱进行高通量快速检测。

一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法，包括以下步骤：

a．制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝胶；

b．样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；

c．电泳；

d．洗胶；

e．将胶在底物溶液中浸泡；

f．反应显色；

步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚兰0.1%、甘油25%组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4：1。