[发明专利]一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法

权利要求书

1.一种蛋白酶谱的活性电泳检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 

a．制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝胶； 

b．样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热； 

c．电泳； 

d．洗胶； 

e．将胶在底物溶液中浸泡； 

f．反应显色。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 

步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚兰0.1%、甘油25%组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4：1。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 

步骤e中将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有质量浓度为0.25-2%底物的溶液中，30-40°C温浴1-3h。 

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤： 

1）．配制质量浓度为12.5%的分离胶：30%凝胶贮备液1.6ml，pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl1.0ml，蒸馏水1.4ml，10%过硫酸胺25μl，TEMED 2.5μl；混匀后立即将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入1ml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5%的上层浓缩胶：30%凝胶贮备液0.15ml，pH6.8的0.5mol/L Tris-HCl 0.35ml，蒸馏水0.5ml，10%过硫酸胺20μl，TEMED 2.0μl；插入梳子，避免混入气泡，放置室温下； 

2）．将样品与加样缓冲液混匀后加样； 

3）．电泳缓冲液为pH8.8的Tris-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，10mA稳流分离样品直至溴酚兰指示剂到达胶的最前沿； 

4）．电泳结束后，用预冷的2.5%Triton X-100将胶洗三次，每次15min；然后用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100； 

5）．将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有质量浓度为1%底物的溶液中，37°C温浴2h后用蒸馏水将胶上残留的底物冲洗干净，用0.1%（w/v）的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色液脱色直至透明条带清晰，其中染色液配方为：1g考马斯亮蓝R-250，350ml乙 醇，100ml乙酸，加水至1000ml；脱色液配方为：250ml乙醇,100ml乙酸,加水至1000ml。