[发明专利]多通道环介导核酸等温扩增定量检测器

说明书

技术领域

本发明属于核酸等温扩增技术领域，具体涉及一种用于多通道环介导核酸等温扩增定量（LAMP）检测器。

技术背景

常规的病原微生物检测方法是采用体外培养技术，但是，仅有约1%的细菌或病毒可以培养，以及培养过程的复杂性和漫长的培养时间，大大限制了这样技术的普及。以聚合酶链反应（PCR）为代表的基于核酸的检测技术发展迅速，为病原体的精确检测诊断提供了可能。经过几十年的改进，PCR方法已从定性发展为定量，能够在几个小时内，从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段，而且特异性也有了极大的提高。然而，从PCR技术的诞生之日起，它始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以PCR为基础的核酸扩增检测技术无法更广泛地推广和应用。

基于这种强烈的需求，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。核酸等温扩增技术不需要温度变化的时间过程，摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。Notomi 等于2000 年开发的环介导等温扩增法( loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 技术，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 条特异引物，并利用一种链置换DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 ℃左右) 保温几十分钟，即可高效、快速、高特异地完成靶核酸序列的扩增反应。该技术不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP 是一种崭新的DNA 扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点，具有替代PCR 方法的可能性。近年来，国外己将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Obuyuki Rayashi等人（2007）针对四种香酒酵母的ITS序列设计了特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。

LAMP法的原理

DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3' 末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3' 末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP引物合成的DNA链。一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5' 末端存在互补的Flc 和Fl 区段，于是发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3'  端为起点，合成互补链，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于F3，B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3' 端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成LAMP法基因扩增循环的起点结构。

在哑铃状结构中，以3' 末端的Fl 区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增。经过相同的过程，又形成环状结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。

该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15～60 min扩增10⁹～10¹⁰ 倍；特异性高，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应，用浊度仪检测沉淀浊度来判定的。