[发明专利]共轭亚油酸的发酵方法及所用菌株

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及菌株的构建及发酵，尤其是一种共轭亚油酸的发酵方法及所用菌株。

背景技术

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，简称CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸，是人体必需的脂肪酸亚油酸（linoleic acid，简称LA）衍生而成的一系列位置和构象异构体的总称。CLA具有抗癌、抗动脉粥样硬化、降低胆固醇、调节血糖、增强机体免疫能力、促进生长等多种生理活性，其中，t10,c12-CLA是最具生理活性的异构体之一。

在自然界中，CLA广泛存在于反刍动物的肉制品和乳制品中，但是含量极低。目前，工业上生产CLA主要采用化学异构法，即通过亚油酸的碱催化异构化。但是，这种方法获得的产物是多种异构体的混合物，除了具有生理活性的异构体外，还含有多种安全性未知的副产物，而活性异构体的分离纯化是十分困难的。采用基因工程技术，获得能够表达亚油酸异构酶的菌株，利用自身的亚油酸异构酶将LA转化成CLA，条件温和，并且能够合成具有生理活性的单一异构体，不仅可以大大简化后续分离纯化的步骤，降低生产成本，而且对于将来CLA用于临床试验以及膳食添加不同CLA异构体的合理配比，都具有混合异构体无法比拟的优点。来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（pai）是唯一一种已知晶体结构的亚油酸异构酶，能够将LA转化成单一的活性异构体t10,c12-CLA，并已在大肠杆菌、酵母、烟草及大米等多种系统中成功的进行了表达。

发明内容

本发明的目的在于利用酿酒酵母表面展示系统表达了来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶，成功构建了一株通过展示亚油酸异构酶能催化合成单一活性异构体t10,c12-CLA的酵母工程菌株，并利用该菌株成功发酵合成t10,c12-共轭亚油酸。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种在细胞壁表达共轭亚油酸异构酶基因的基因工程菌，含有亚油酸异构酶基因，基因序列见序列3，表达载体的pYD1，宿主菌为酿酒酵母EBY100。

而且，所述共轭亚油酸为t10,c12-共轭亚油酸。

在细胞壁表达共轭亚油酸异构酶基因的基因工程菌的培养方法，步骤为：将所述基因工程菌接种到含有半乳糖的YNB-CAA培养基中，诱导培养，离心，收集菌体。

而且，所述半乳糖浓度为1-2%(W/V)。

而且，所述诱导培养温度为20-25°C，诱导培养时间为48-96h。

而且，将所述工程菌加入到含有底物亚油酸的缓冲液中进行振荡反应，反应后获得共轭亚油酸。

而且，所述缓冲液pH为6.5-7.5。

而且，所述缓冲液磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

而且，所述振荡反应温度为30-37°C，振荡反应时间为4-36h。

一种制备共轭亚油酸的全细胞催化剂，含有如权利要求1所述的基因工程菌，所述共轭亚油酸为t10,c12-共轭亚油酸。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明通过将来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶基因插入载体pYD1中，构建了表达载体pYD1::pai，并将它导入酿酒酵母EBY100中，获得含有表达载体pYD1::pai的酿酒酵母菌株EBY100-pYD1-pai，本菌株经诱导培养后，PAI成功的展示在酿酒酵母细胞壁表面，能够与底物亚油酸充分接触，并将LA转化为单一活性异构体t10,c12-CLA。

2、本发明首次利用酿酒酵母表面展示系统，将亚油酸异构酶基因展示在细胞壁表面，使得底物能够与其充分的接触，既能够提高亚油酸异构酶的催化效率，又能够获得具有生理活性的单一异构体，不需要再进一步纯化分离，提高生产效率。

3、本发明利用微生物表面展示系统将亚油酸异构酶连接在酿酒酵母细胞壁上，使细胞外底物与酶充分接触，提高催化效率，并且能够获得具有生理活性的单一异构体，省掉分离纯化步骤，降低生产成本。

附图说明

图1为本发明酿酒酵母表面展示系统原理示意图。

图2为本发明表达载体pYD1::pai的结构示意图。

图3为本发明pYD1::pai转化酿酒酵母PCR鉴定电泳结果图。

图4为本发明EBY100-pYD1-pai表面展示亚油酸异构酶催化合成t10,c12-CLA的产量测定图。