[发明专利]一种转精氨酸酶基因玉米育种方法

权利要求书

1.一种转精氨酸酶基因玉米育种方法，其包括如下步骤：

（1）以pCAMBIA5300-ubi-Tnos为基础载体，去除原来载体的HPT基因，换上了来自NK603中35S驱动的CP4EPSPS基因，将精氨酸酶基因ZmArg、异戊烯基转移酶基因ZmIPT2和细胞壁转化酶基因ZmMn1插入多克隆位点SmaⅠ之后，构建单子叶植物超量表达载体；

（2）单子叶植物超量表达载体经三亲杂交法将目的基因转移至农杆菌，挑取单菌落，进行PCR鉴定得到目标农杆菌；

（3）试验材料的准备:自交系玉米种子分别在60-80%酒精浸泡40s-50，0.05-0.15%升汞消毒8-12min，无菌水冲洗，然后将种子浸泡在无菌水中，置于37℃水浴中4～5h；

（4）农杆菌侵染萌动胚：在超净台里用解剖刀在玉米萌动胚的生长点处划开1～3mm的口子，放入制备好的农杆菌工程菌液中浸染芽尖，26-30℃，200-240r/min振荡20-28h，然后把种子放在MS固体培养基上共培养2-4d；

（5）移栽：用清水洗掉菌体，转入2-6mg/LPPT的选择培养基中培养7-10天，除去矮化、生长缓慢的植株，选择正常的移栽到装有灭菌蛭石的营养钵中；

（6）在转化苗长到3-4叶期时，均匀喷洒合适浓度的草甘膦水溶液行筛选，存活植株长到5-6叶期时移栽到田间收获目标玉米种。

2.根据权利要求1所述的育种方法，所述的ZmArg基因序列为SEQ ID NO.1。

3.根据权利要求1所述的育种方法，所述的步骤（1）具体步骤如下：

（1）用SacⅡ和AatⅡ双酶切载体pCAMBIA5300去除潮霉素基因(HPT)后，将其左边界(T-border)序列重组连接，连接产物转化E.coli DH5，挑取单菌落碱裂解法提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定；

（2）将EPSPS基因与经AatⅡ酶切去除潮霉素基因的载体pCAMBIA5300后重组连接，产物转化E．coli DH5感受态细胞，挑取单菌落振荡培养过夜并用碱裂解法提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定和质粒PCR检测；

（3）将扩增得到的ZmArg基因和经Sma Ⅰ酶切后的线性中间载体；pCAMBIA5300-EPSPS重组连接，转化E．coli DH5感受态细胞，挑取单菌落震荡培养过夜并用碱裂解法提取质粒；

（4）三亲杂交法将目的基因转移至农杆菌，挑取单菌落，进行PCR鉴定得到目标农杆菌。

4.根据权利要求1所述的育种方法，所述的自交系玉米种子选自KF298、KF513或K10。