[发明专利]具有改进活性的DNA聚合酶

说明书

发明领域

本发明提供了具有改进活性(包括增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或逆转录酶(RT)和聚合酶抑制剂的耐受性)的DNA聚合酶，以及这种聚合酶在各种应用中的用途，包括核酸多核苷酸延伸和扩增中的用途。

发明背景

DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间(from generation to generation)精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂如Mg²⁺存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每一DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次以产生相同的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如美国专利号 4,683,202)。

在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一轮DNA复制的开始时添加的(参见上述美国专利号4,683,202)。后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获得热稳定DNA聚合酶，且这些酶只需要添加一次(参见美国专利号4,889,818和美国专利号4,965,188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆地失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键。特别是对于诊断应用，目标核酸序列可能仅仅是所考察(in question)DNA或RNA的一小部分，因此在不扩增的情况下可能难以检测到目标核酸序列的存在。

DNA聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，并包含手掌、手指和拇指三个不同的亚结构域。(参见Beese等, Science 260:352-355, 1993)；Patel等, Biochemistry 34:5351-5363, 1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但是催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，在化学催化作用期间与引入的dNTP相互作用并稳定过渡态的基序A在哺乳动物polα和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之间是重叠的，平均偏差约为1?(Wang等, Cell 89:1087 -1099, 1997)。在结构上基序A以主要包含疏水性残基的反向平行β-折叠链起始，并延续到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。在基序A的情况下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:22)保留在从数百万年进化分离的生物体包括例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和大肠杆菌(Escherichia coli)的聚合酶中。

除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够容纳某些氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如，美国专利号6,602,695)。这种突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择优势。