[发明专利]制备用于药物递送的脂质纳米颗粒的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年11月4日提交的美国临时专利申请第61/556,124 号的优先权，其整体援引加入本文。

技术领域

本文涉及一种简单且可重复地形成脂质-核酸颗粒的方法。所述方法产生平均大小为50-150nm的单分散的颗粒。

背景技术

脂质可以用作载体用于递送治疗分子，特别是用于递送核酸。脂质形成脂质体，其可以包裹、络合或包埋核酸分子，从而在给药(例如静脉内给药至循环)时增加递送这类治疗分子至靶细胞。它们在药物组合物中的有用性受到可用于可重复地制备脂质-核酸纳米颗粒的方法的限制。已设计各种方法以制备这类纳米颗粒。

Batzri et al.,1973,Biophys Biochem Acta298:1015-19和Kremer et al., 1977,Biochemistry16:3932-35描述了通过将脂质溶于乙醇并将该乙醇溶液注射入水溶液来制备脂质囊泡，其中脂质自发地形成脂质体。Hirota et al., 1999,BioTechniques27:286-89描述了通过将阳离子脂质溶于乙醇并将该乙醇溶液注射入包含核酸分子的水溶液来制备包被核酸分子的脂质囊泡。这种方法不能制备包裹核酸的脂质体。

Maurer et al.US7094423描述了通过首先制备水溶液中的预制单层脂质囊泡来制备包裹核酸的脂质体。通过将脂质溶于乙醇并将该脂质混合物注射入水性缓冲液来制备预制脂质囊泡。制备空的预制囊泡的过程包括通过挤出分选大小。分选大小之后将乙醇添加至空的预制囊泡以使它们不稳定，并且将40％乙醇中的核酸添加至不稳定的脂质囊泡。温育之后，将该混合物渗滤以去除乙醇。乙醇百分比、温度、温育时间、脂质组成、药物/ 脂质比例和初始核酸浓度的变化均影响这种方法的包裹效率和收率。例如， Maurer等人证实包埋随着寡核苷酸:脂质比例的增加而增加，在超过0.16mg 反义寡核苷酸/mg脂质时达到最大，同时产生较大脂质体的数量和它们的多分散性的增加。

Semple et al.US6858225利用可电离的阳离子脂质制备包裹RNA的脂质体。将脂质溶于乙醇并与低pH的水性缓冲液中的核酸组合。去除乙醇并将pH调至中性pH以形成脂质体。所得的脂质体是异质的，需要匀浆或挤出以获得单分散脂质囊泡。与Maurer等人一致，Semple等人证实包埋随着寡核苷酸:脂质比例的增加而增加，在超过0.16mg反义寡核苷酸/mg脂质时达到最大，同时产生较大脂质体的数量和它们的多分散性的增加。

MacLachlan et al.US7901708描述了通过在混合室(T-管)中混合溶于乙醇的脂质与水溶液中的RNA来制备包裹RNA的脂质囊泡，其中将脂质和 RNA逐步稀释，从而基本上立即形成囊泡。

Wheeler et al.US20100041152描述了制备包裹RNA的脂质体，将阳离子脂质溶于乙醇并与65-85％乙醇中的RNA混合以产生可溶的电荷中和的复合物，将非阳离子脂质添加至这个复合物以形成脂质-核酸混合物并去除乙醇。脂质体需要匀浆或挤出以获得单分散脂质囊泡。

对包裹核酸而不需要广泛的机械加工步骤以制备预制脂质体且不需要加工步骤将脂质-核酸颗粒减少为单分散群体的制备方法仍有相当的需求。

发明内容

本文的一方面是一种制备包裹聚阴离子的脂质纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：以恒定速率将包含溶于与水混溶的有机溶剂的脂质的第一溶液添加至包含水性缓冲液中的聚阴离子的第二溶液，同时搅拌所述第二溶液以制备包含25-45％(v:v)的所述有机溶剂的混合物；以及通过相对于中性pH的水性缓冲溶液进行渗滤来从所述混合物去除所述有机溶剂。将所述第一溶液添加至所述第二溶液优选在1-100分钟内完成。所述聚阴离子可以为核酸，例如RNA分子。所述聚阴离子优选的浓度为0.08-0.8mg/ml。所述脂质纳米颗粒的药物:脂质比例(w:w)优选为0.06-0.16。所述脂质纳米颗粒的药物:脂质电荷比例为1:25:1-1:1。

所述方法的另一实施方案为使用水溶液中的多糖。所述多糖优选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、乳糖、麦芽糖和菊粉。所述方法的另一实施方案还包括冷冻干燥所述包裹聚阴离子的脂质纳米颗粒的步骤。

在所述方法的另一实施方案中，所述有机溶液优选为乙醇。优选地，在完成所述脂质和所述聚阴离子的混合物时，所述混合物包含35％(v:v)的乙醇。