[发明专利]用于转基因植物的高通量筛选方法

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2011年8月2日的美国临时申请61／514052的权益，其全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及植物基因工程。其涉及用于筛选转基因植物对于转基因的存在和表达的方法和组合物。

背景技术

植物基因工程近来的进步已打开了工程化植物以具有改善的特性或性状的新的大门。这些转基因植物在其基因组中典型地具有重组DNA体，其具有可操作地连接至多个调控区的转基因，所述调控区使所述转基因准确的表达。转基因植物中几个帮助调控基因表达的调控元件的例子为启动子、内含子、终止子、增强子和沉默子。

植物基因工程已发展至将多种性状引入商业上重要的植物中，也称为基因堆积。这是通过多基因转化实现的，多种基因在其中被转化，以产生可能表达复合表型或多种表型的转基因植物。

调控序列位于包含转录终止和3′mRNA加工所需信号的编码区的下游，被称为终止子序列。所述终止子序列在mRNA加工、定位、稳定性和翻译中起关键作用(Proudfoot，N，(2004)Curr Opin Cell Biol16：272-278；Gilmartin，G.M.(2005)Genes Dev.19：2517-2521。包含在终止子序列中的3’调控序列能够影响基因的表达水平(Ingelbrecht等人(1989)Plant Cell1：671-680)。

基因工程的挑战之一是转基因植物的分子鉴定，以检测和测量转基因植物中转基因的拷贝数和表达。所述转基因DNA是被随机插入植物基因组中，能导致在一个或多个染色体位点整合进多个转基因拷贝的转基因植物中基因沉默。因此转基因拷贝数的估算是转基因植物的分子鉴定的重要步骤。已经采用技术诸如southern印记、比较基因组杂交、荧光原位杂交和使用基因特异性引物的聚合酶链反应(PCR)以测量所述转基因的拷贝数(Yang等人Plant Cell Rep(2005)23：759-763)。采用技术诸如Northern印记和使用基因特异性引物的逆转录酶PCR以对转基因的表达定量。这些技术可以是乏味的并容易出错(Toplak等人2004；Plant Molecular Biology Reporter22：237-250)。

使用定量或实时PCR用于测定转基因植物中转基因表达或拷贝数是有缺点的，因为当对于每个不同的转基因用基因特异性引物和探针时它可能是昂贵的。此外，每个引物组的效率可能不同，这会妨碍以高通量方式对转基因拷贝数和表达分析的测定。如果所述转基因植物除了被引入的拷贝外有所述基因的内源性拷贝，测量特异性来自所述转基因的表达可以为困难的。

发明内容

本发明涉使用定量或实时聚合酶链反应(QPCR或实时PCR)用于量化转基因植物中异源多核苷酸的表达水平或量化其拷贝数的方法，其中使用了对可操作地连接至异源多核苷酸的异源终止子序列特异性的引物组进行实时PCR。本发明所述方法能用于以高通量方式测定转基因植物中异源多核苷酸的表达水平或拷贝数。

本发明的一个实施例是量化转基因植物或植物细胞中异源多核苷酸表达水平的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从转基因植物或植物细胞分离核酸，其中所述转基因植物或植物细胞包含可操作地连接至异源终止子序列的异源多核苷酸；以及(b)使用正向引物和反向引物通过实时逆转录酶聚合酶链反应来量化所述异源多核苷酸的表达水平，其中所述正向引物和所述反向引物与所述异源终止子序列或其互补序列杂交。在另一个实施例中，使用与所述异源终止子序列或其互补序列杂交的探针通过定量或实时逆转录酶PCR来进行所述异源多核苷酸的表达水平的量化。

本发明的另一个实施例是测量转基因植物或植物细胞中异源多核苷酸的拷贝数的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从转基因植物或植物细胞分离核酸，其中所述转基因植物或植物细胞包含可操作地连接至异源终止子序列的异源多核苷酸；以及(b)使用正向引物和反向引物通过实时聚合酶链反应来量化所述异源多核苷酸的拷贝数，其中所述正向引物和所述反向引物与所述异源终止子序列或其互补序列杂交。在另一个实施例中，使用与所述异源终止子序列或其互补序列杂交的探针通过定量实时PCR来进行所述异源多核苷酸的拷贝数的量化。