[发明专利]将靶向肽偶联于重组溶酶体酶上的方法

说明书

本申请描述了制备与重组溶酶体酶偶联的靶向肽的方法，其通过使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)‑末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶，使用第二交联剂修饰变体IGF‑2肽的氨基(N)‑末端的短延长接头的第一个氨基酸以产生第二交联剂修饰的变体IGF‑2肽，然后将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述含有短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF‑2肽偶联。本申请还描述了使用本申请所公开的方法合成的偶联物，所述偶联物的特征为与IGF2/CI‑MPR受体具有更高的亲和性和能够被细胞摄取。本申请还描述了使用所公开的偶联物的治疗方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月27日提交的美国临时专利申请号61/490,957的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

技术领域

本申请的技术领域涉及肽化学。本申请的技术领域还涉及在溶酶体贮积症的治疗中将重组溶酶体酶靶向至溶酶体。

背景技术

溶酶体是一种专门的细胞内细胞器，蛋白质、多种脂质(包括糖脂和胆固醇)和碳水化合物在其中降解并重循环成最基本组分，这些最基本的组分能够合成新的蛋白、膜组分和其他分子。通过被称为自噬的适应性细胞过程，细胞还利用溶酶体帮助维持内环境稳态和细胞的健康，该过程增加溶酶体的活性以便为增加的多种蛋白质(例如，抗体和干扰素)的生物合成提供额外的氨基酸，并且为能量产生过程提供营养物以应对营养剥夺或病毒感染的应激期。各个代谢过程由特定的固有溶酶体酶催化。基因突变能够引起溶酶体生物活性的缺乏，其使得代谢过程改变并导致临床疾病。溶酶体贮积症(LSD)是由约50种不同的人类代谢疾病组成的一类疾病，其由缺乏特定的溶酶体蛋白引起，结果使得多种物质在内涵体/溶酶体区域蓄积。已对多种这些疾病进行了很好的鉴定以了解缺乏的溶酶体蛋白和其所导致的代谢缺陷。例如，存在糖脂分解代谢改变的若干LSD如戈谢氏症、法布瑞氏症和台萨氏/桑德霍夫病。鉴定Neimann-Pick C为脂质和胆固醇代谢受损，还鉴定了碳水化合物代谢改变的疾病如II型(庞贝氏症)和III型(科里-法布瑞氏症)糖原贮存疾病。其他LSD改变骨或细胞外基质[例如，粘多糖贮积症(MPS I-VII)，戈谢氏症]的代谢和蛋白的更新(神经 元蜡样脂褐质沉积症；Batten等)。尽管LSD相对罕见，但是如果未进行有效治疗，则其能够导致严重的慢性疾病并且往往会导致死亡。

尚无能够治愈溶酶体贮积症的方法，但是已经研究了用于治疗多种LSD的多种不同的治疗方法，包括骨髓和脐带血移植、酶替代疗法(ERT)、底物减少疗法(SRT)和药物伴侣疗法。还开发了基因疗法但是尚未经临床检验。在这些治疗方法中，ERT是最成熟的，已有多种ERT被批准用于治疗多种LSD，包括戈谢氏症、法布瑞氏症、庞贝氏症、MPS I、MPS II和MPSVI，而仅有一种SRT药物被批准用于治疗戈谢氏症。

ERT用于治疗溶酶体贮积症的原理相当明确，即将重组人溶酶体酶给予患者以补充其缺乏的生物活性并改善临床症状。然而，与主要在细胞表面或细胞外发挥功能的其他蛋白治疗疗法(例如，抗-VEGF和其他抗体、促红细胞生成素、凝血因子等)不同，溶酶体酶必须在细胞内的溶酶体内发挥功能，因而需要一种由细胞外进入细胞随后递送至这些内部区室的机制。在哺乳动物中，对大多数可溶性溶酶体酶而言，蛋白骨架上的分支碳水化合物结构在某些天冬酰胺残基(N-连接的寡糖；N-聚糖)上被翻译后修饰以形成称为甘露糖6-磷酸(M6P)的特殊碳水化合物结构。M6P是天然生物信号，其由膜结合M6P受体识别并将新合成的溶酶体蛋白从高尔基体向溶酶体转运。一类M6P受体(不依赖于阳离子的M6P受体；CI-MPR)还能够循环至质膜，并被功能性活化以结合和内化外源性的溶酶体蛋白。据信CI-MPR已发展成能够重新捕获从细胞中逃逸(分泌出细胞)的溶酶体蛋白，因此其提供了一种内化外源性溶酶体蛋白的靶机制，并且是治疗多种LSD的酶替代疗法的基础。