[发明专利]用于筛选肌酸转运蛋白缺陷的组合物和方法

说明书

本申请根据35U.S.C.§119要求于2011年5月26日提交的美国临时申请序列号61/490,192的优先权，所述美国临时申请的内容在此通过引用全文并入。

本公开内容涉及引物、试剂盒和筛选方法，并且更具体而言，涉及扩增和测序引物、用于筛选的试剂盒、和用于鉴定SLC6A8肌酸转运蛋白基因突变的筛选方法。

近来已存在美国和全世界中的孤独症谱系障碍诊断的增加。这多少是由于更佳的诊断测试，更多公众意识和用于该谱系中存在的一些疾病的有效治疗的开发。最近估计表明多达60/10,000个儿童显示孤独症症状。X-连锁智力低下（下文“XLMR”）限定一组这些障碍，其中问题存在于X染色体内；存在已知基因中的广泛多样突变，并且更多突变每年在全世界被发现。在西方国家，智力低下影响2-3%的一般人群。对于大多数这些病例，原因仍有待确定，但受累男性普遍超过女性（约70%男性）指示XLMR对这个患者人群的显著贡献。XLMR被认为占5-12%的所有智力低下（下文“MR”）。约2.1%的XLMR可以追溯到编码肌酸转运蛋白蛋白质的SLC6A8基因中的突变。

肌酸转运蛋白缺陷（例如“CTD”）是基于在Cincinnati Children’s Hospital Medical Center的一组患者，在2001年首次描述的肌酸代谢的X连锁先天性障碍。这种疾病的临床标志包括智力低下、表达型语言障碍、局限性癫痫和孤独症特征。这些症状的严重性可以随着早期实现的治疗策略而减小，使得早期诊断成为必需。儿童在诊断前越年长，用治疗策略解决发育迟缓越难。

SLC6A8基因是负责神经递质转运的溶质载体家族成员。位于Xq28上的SLC6A8基因跨越约8.4kb，并且由13个外显子组成。编码的蛋白质是635个氨基酸，具有70kDa的预测mw。SLC6A8基因被认为在脑、骨骼和平滑肌以及肾中表达。存在被认为仅在睾丸中表达的另一种形式的转运蛋白。

SLC6A8基因中的众多突变已得到鉴定，所述突变影响肌酸转运且导致肌酸转运缺陷。因此，在基因内引起肌酸转运蛋白缺陷的突变的鉴定要求分析SLC6A8基因的编码区的整个DNA序列。SLC6A8基因与编码溶质载体家族的其他成员以及假定蛋白质（例如XP_002343512）的基因高度同源，使得它难以选择性扩增且测序。例如，假定蛋白质与肌酸转运蛋白共享约95%同源性。由于这个同源性，SLC6A8基因中的突变鉴定一般已要求使用针对SLC6A8基因的短非同源区段的引物，测序许多更小区段中的基因。以这种方式测序整个基因目前是耗时、费力和低效的。因此，需要引物和方法以增加就突变分析SLC6A8基因的效率，以及减少就突变分析SLC6A8基因的时间，以增加筛选这种障碍的有效性。

目前，当诊断呈现肌酸转运蛋白缺陷中可见的症状谱的儿童时，首先在该儿童中检查线粒体电子传递链功能障碍。如果没有任何发现，则执行皮肤活组织检查（或渐增的抽血），以采集足够的组织用于功能和基因测试。获得的皮肤量不足以用于遗传、功能和生物化学分析，并且要求对受试者的疼痛操作。高度期望能够以创伤少得多的方式收集样品，并且能够收集足够的组织用于遗传、功能和生物化学分析。

一旦获得组织，就将它送到由CLIA批准用于基因测试的经认证的诊断实验室。目前全世界仅存在执行SLC6A8整个编码区的基于DNA的序列分析的6个实验室，其中仅三个位于美国，并且其中无一执行肌酸转运蛋白动力学测试，以测定肌酸转运蛋白功能障碍的水平。这个过程是耗时的并且有时是创伤性的过程，其中可以用于实现早期干预策略的宝贵时间丧失，所述早期干预策略已显示改善接受早期诊断的受试者的结果。

关于这个缺陷的实际诊断数目是增长中的，超过能够执行该测试的少数实验室的能力，并且目前采用的诊断方法不能有效按比例增加以处理大量新生儿的筛选。这个需要是特别明显的，因为由于验证筛选的缺乏，American College of Medical Genetics决定不推荐在新生儿中筛选该障碍。因此，需要用于在大量受试者中筛选肌酸转运蛋白缺陷的方法和组合物。

即使在具有诊断能力的实验室，也不存在基于诊断发现调整治疗策略的尝试。简明地，目前在美国没有实验室具有能够广泛肌酸转运蛋白缺陷筛选和/或功能概况、基于诊断发现对治疗作出后续调整的科学和专家鉴定能力和肌酸转运蛋白患者人群。