[发明专利]核酸的分离

说明书

本发明要求美国临时专利申请序列号61/485,214、61/485,338、61/485,386、和61/485,448的权益，其每一项均于2011年5月12日提交，并且其每一项通过引用整体并入本文。

领域

本文提供了与分离核酸相关的技术。具体地，本技术涉及从成问题的样品例如粪便提取核酸的方法和试剂盒。

发明背景

从样品分离特定的靶核酸是许多医学诊断测定中的重要步骤。例如，已知基因中的某些突变和甲基化状态是与疾病相关、伴随或预兆性的。可从样品中回收包含这些基因的DNA并且测试具体突变和甲基化状态的存在。

实际上，这些测定需要从样品分离并测定若干基因靶。对于许多检测方法来说，检测单个基因中的罕有突变或甲基化状态需要分离并且测试大量的DNA。这一问题在测定一组基因时被加剧，所述基因中的每一个必须大量存在以用于稳健的诊断测试。因此，为了检测多个基因中的罕见突变和甲基化事件，所分离的DNA必须被高度浓缩并且组成检测测定的很大部分。

然而，这一需求带来了许多问题。例如，制备这样的量和浓度的DNA需要大的样品作为投入物（例如具有几克例如大约2-4克的质量）以提供足够核酸用于检测并且因此需要可从大的样品制备DNA的方法。此外，测定抑制剂常常随着DNA制品一起被分离和浓缩。因此，通过常规方法生产的浓缩的DNA制品同样常常保留不可接受的浓度的抑制剂，其之后被引入随后的测定中。而且，如果在大批的非选择性的DNA制品中同时提取组中的所有靶，那么测定的敏感度受损，因为当制品被分为等份用于测试时测定中存在是较少的从组中任一种基因提取的DNA。如果另一方面，组中的所有成员被一起提取和测试并且由此存在于同一测定混合物中，那么检测任一种单个的特定靶的敏感度因非靶DNA分子的存在而受损。

此外，如果复杂的样品中存在特定的诊断靶，那么它将以相对于样品中其他材料—核酸和非核酸两种—相对小的量存在，因此为设计用于检测其的分析方法带来了挑战。例如，来自粪便样品的DNA的分析因细菌构成了粪的大约60%的干重而其余的大部分是作为食物被受试者消化的植物和动物物质的残留的事实而变得复杂。像这样，仅是从消化道的内膜蜕化的那些的人类受试者的细胞是粪便中非常小的部分并且存在大量来自其他材料的核酸。而且，在检测指示直肠癌的基因修饰的测定中，来源于直肠中可能存在的肿瘤的细胞将仅占从消化道内膜蜕化的人类受试者消化道细胞的一小部分。因此，癌细胞（和它们包含的DNA）构成极小量的粪便质量。这样的样品同样常常是非常粘性的，其在核酸的样品制备和分离上存在问题。

从样品分离DNA的常规方法和试剂盒通常从样品制备总DNA（例如通过非特异性的制备方法）。对于复杂的样品例如粪便样品来说，这是常规方法特有的缺点，因为从粪便样品分离的总DNA包含伴随来自受试者的DNA一起的来自消化道常驻细菌（以及存在的任何病毒、真核生物以及古生菌）的DNA。而且，常规方法和试剂盒主要设计用于从小样品例如具有少于1克诸如50至200毫克的质量的样品制备DNA，将来自复杂样品的靶核酸的产量限制在非常小的量。另外的缺点是大多数常规技术并不有效地去除抑制剂并且常常需要长的加工步骤，例如孵育。因此，常规方法不适于高敏感度和高特异性的多个基因组分析，因为它们不能从大的样品例如几克的粪便样品制备足够量的高度浓缩的无抑制剂的DNA。使用用常规方法制备的DNA的测定将不能提供可以检测罕有的突变或甲基化事件所需要的敏感度阈值测定的样品。使用常规方法或试剂盒获取获得这样的敏感度所需的起始质量需要除了额外的纯化步骤之外的多重DNA提取（例如使用多重试剂盒）以去除抑制剂。因此，所需要的是从样品制备一组基因的每个成员的浓缩的无抑制剂的DNA以便在诊断测定中使用。

概述

本文提供的是与分离核酸有关的技术。具体地，所述技术涉及用于从粪便样本中脱落的肠道细胞提取并且纯化核酸以便用于定量和敏感的测定。所述技术具体为使用抑制剂去除步骤从粪便纯化特定DNA以及从粪便上清液直接捕获DNA或这些步骤的组合的新方法。所述技术进一步提供了适于与复杂并且粘性的样品例如粪便样品一起使用的过滤设备。因此，本文提供的是从样品分离靶核酸的方法，所述方法包括从样品去除测定抑制剂，如果存在的话，以产生澄清的样品；用捕获试剂从澄清的样品捕获靶核酸，如果存在的话，以形成捕获复合物；从澄清的样品分离捕获复合物；并且从核酸溶液中的捕获复合物回收靶核酸，如果存在的话。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在捕获步骤之后保留澄清的样品；和使用所保留的澄清的样品和第二捕获试剂重复分离和回收步骤。