[发明专利]用于核酸操作的方法和材料

说明书

背景

本发明涉及核酸操作和特别地DNA操作领域，及其用途。特别地，本发明涉及有关核酸连接的方法，以及此类连接核酸的用途，例如用于产生转化的微生物。此外，本发明涉及用于此类方法的材料。

对于核酸操作方法，存在持续的需求。例如，分析核酸或其编码的蛋白质的功能，通常，有帮助的是产生所述核酸的变体，特别地具有不同碱基序列的变体。同样地，对于构建高效的产生菌株或载体，通常期望的是组合几个核酸片段，例如以产生在期望的调控元件的控制下的几个基因或外显子。

出于实践的原因，通常不需要用全长核酸操作。相反，获得、修饰并然后组合更小的区段，以获得经修饰的全长核酸。通常，区段的数量随着核酸中引入的修饰的数量而增加。此外，对于克隆或表达目的，通常会操作核酸并插入到载体中。

对于涉及组合两个或两个以上核酸的操作方法，实现稳定组合的需求是通常遇到的问题。对于用组合的核酸转化细胞，组合的稳定性是特别要求的。在转化期间和之后，例如通过强制转移到细胞中，以及通过经设计用于去除外源核酸的酶，使核酸受到胁迫。

通常，观察到包含切口，即一个链的相邻核苷酸之间磷酸二酯骨架中断裂的组合核酸易于分解。此外，带切口的核酸将实现低转化效率。例如，Vroom和Wang(BioTechniques 2008,924-926)描述了涉及载体和许多插入片段的克隆实验。通过13-15个核苷酸的重叠来连接插入片段和载体，以使载体和每一插入片段都可以将切口加入到组合的核酸中。作者观察到，对于每一另外的插入片段，都降低了转化体的数量一个数量级。例如，当仅一个插入片段存在时，观察到261个克隆，当两个插入片段同时存在时，观察到仅16个克隆，并且对于三个插入片段，观察到仅3个克隆。因此，在组合的核酸如质粒的构建中，应当避免切口的存在。并且特别地对于经修饰的核酸文库的构建，必须避免切口的存在，因为低转化效率会阻碍或者不可接受地妨碍转化体文库的产生。因此，构建携带不同核酸的转化细胞的文库是很繁重的工作，并因此，目前对于分析和比较大量核酸变体的功能，或者组合几个核酸区段是困难的。

因此，期望的是避免组合的核酸中切口的存在，特别地当将此类核酸用于产生转化体时。因此，通常通过连接酶的作用或者通过不带切口的链的合成，例如通过核酸聚合酶的作用来试图连接组合核酸的磷酸二酯骨架。

然而，连接是相当繁琐的方法，并且连接效率可能在没有明显原因的情况下改变。并且也认为通过核酸聚合酶的扩增是不想要的额外步骤，并可能导致人工产物。

因此，存在提供用于连接多个核酸，以去除或减轻现有技术的以上缺点的方法的需求。该方法应当允许组合至少3个、优选地至少4个和更优选地至少5个核酸。此外，该方法应当允许实现高转化效率。该方法应当允许产生用于转化体文库产生的组合核酸。此外，该方法应当是可靠的、快速的，并应当不需要昂贵的材料或设备。

发明详述

根据本发明，提供了连接核酸的方法，包括：

a)提供待连接的一组至少3个核酸，其中核酸片段包含成对的可相容末端，并且其中至少两个核酸片段是至少在各个可相容末端的区域中是双链的，并且其中各个可相容末端的每一相反链包含用于非酶促去除所配置的核苷酸，

b)非酶促去除用于非酶促去除所配置的此类核苷酸，

c)在杂交条件下混合核酸片段。

目前令人惊奇地发现，通过根据本发明制备如上所述的片段，即通过非酶促去除用于非酶促去除所配置的核苷酸，可以获得可高效率转化的连接的核酸，即使各个连接的核酸包含切口。特别地，本发明方法取消了通过连接或聚合酶反应来实现具有高转化效率的可转化组合核酸的需求。因此，如后面所说明，本发明方法有利地适合于需要转化步骤的多种应用。

此外，本发明提供了连接多个核酸片段的令人惊奇的有效方法，而无需使用产生可相容末端和连接此类可相容末端的酶。本发明人发现，即使用连接酶进一步处理根据本发明连接的核酸，与未连接的连接核酸比较，并没有显著增加转化效率。这是不期望的，因为带切口的核酸在转化期间或之后比不带切口的核酸更可能分解；因此，期望的是连接对于实现高转化效率是必需的或者至少是有帮助的。目前，本发明人推断，核苷酸的非酶促去除提供了产生单链可相容末端的意外有效的方法；这是特别令人惊奇的，因为进化至今应该已经发展了用于连接和产生可相容末端的几乎最佳的酶。因此，令人惊奇的是，与在产生和/或连接核酸片段中涉及酶的方法比较，根据本发明的转化效率可以是相同的或者甚至更高。