[发明专利]木糖发酵微生物

说明书

技术领域

本发明涉及使NAD激酶基因的表达功能丧失的微生物。此外，本发明涉及通过使NAD激酶基因的功能丧失来制作木糖发酵能力增加的发酵微生物的方法。本发明进一步涉及包含使所述微生物与含有木糖的原料接触的工序的乙醇的制造方法。

背景技术

近年来，从化石燃料的枯竭、有必要削减CO₂气体这样的观点出发，进行了如下研究，即将以往作为废弃物的玉米芯、稻草、柳枝稷、斑茅、废木材等这样的生物质作为燃料来生成乙醇。人类从几千年前开始就已具有从淀粉通过由酿酒酵母进行的发酵来制成乙醇的技术。淀粉是葡萄糖α-1,4键合而成的多糖，通过各种各样的生物所具有的水解酶可容易地分解。此外，葡萄糖是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最为优选的C源，可通过发酵由1分子的葡萄糖生成2分子的乙醇。相对于此，生物质作为多糖包含纤维素或半纤维素。

其中，纤维素是葡萄糖β-1,4键合而成的多糖，具有结晶结构。其存在以下问题，即有必要进行用于损坏结晶结构的前处理、为了分解纤维素而必需的纤维二糖水解酶Ⅰ、纤维二糖水解酶Ⅱ、内切葡聚糖酶等的活性不充分等，但是由于分解后所产生的糖为葡萄糖，所以用酿酒酵母来发酵没有任何问题。

相对于此，半纤维素除了葡萄糖以外，还包含木糖、阿拉伯糖这样的五碳糖，以往酿酒酵母并不能发酵这些五碳糖。因此，为了发酵木糖，经常使用以下方法，即,使具有发酵木糖的能力的树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中高表达(图1)。树干毕赤酵母的木糖还原酶为主要使用NADPH作为辅酶的酶，反应后生成一分子的NADP。另一方面，木糖醇脱氢酶为主要使用NAD作为辅酶的酶，反应后生成一分子的NADH。因此，如图1所示的那样，在发酵葡萄糖时，NADP/NADPH或NAD/NADH的平衡没有变化，但是发酵木糖时，偏向NADP或NADH增加的方向。可以认为这就是由木糖进行乙醇发酵时的收率低的原因。

迄今为止，进行了以下尝试，即,将辅酶特异性变换为NADH的突变型木糖还原酶的制作(非专利文献1)、将辅酶特异性变换为NADPH的突变型木糖醇脱氢酶的制作(非专利文献2)、糖酵解途径的甘油醛三磷酸脱氢酶的辅酶特异性为将作为NADPH的酶的基因从其它的生物种导入的实验(非专利文献3)、使大肠杆菌等的细菌所具有的转氢酶(在NADPH与NAD或NADP与NADH之间进行氢的交换)表达(非专利文献4)等，但是并没有得到充分的效果。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Petschacher B,Nidetzky B.Microb Cell Fact.2008 Mar 17;7:9.

非专利文献2：Watanabe S,Saleh AA,Pack SP,Annaluru N,Kodaki T,Makino K.J Biotechnol.2007Jun30;130(3):316-9.Epub 2007 Apr 29.

非专利文献3：Verho R,Londesborough J,Penttile M,Richard P.Appl Environ Microbiol.2003 Oct;69(10):5892-7.

非专利文献4：Mikael Anderlund et.al.Appl Environ Microbiol.1999 June 65(6):2333-2340

发明内容

在此种情况下，有必要开发出经过长时间也能维持木糖的发酵能力的微生物。

作为提高木糖发酵中的乙醇收率的方案，本发明人等认为重要的是增加细胞内的NAD或NADPH，从而着眼于NAD(H)激酶进行了深入研究，结果发现通过破坏NAD(H)激酶基因，可阻止

NAD+ATP→NADP+ADP

的反应中的NAD的减少。因此，制作破坏了NAD激酶基因的酵母株，并在该酵母株中进行了木糖的发酵，结果判断出与野生型的相同株相比乙醇收率提高。

本申请发明为基于上述见解的发明。

即，本发明涉及以下内容。

[1]一种微生物，其特征在于，其使NAD激酶基因的表达功能丧失。

[2]根据上述[1]中所述的微生物，其特征在于，所述NAD激酶基因是选自UTR1基因、YEF1基因中的至少一种的基因。