[发明专利]改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质，解决使用原来的洗涤液和洗脱液配比做出的产品杂质多并且在以后的步骤中难以去除的问题，提高了分离度。 

背景技术

绒促性素(Chorionic Gonadotrophin)系自健康孕妇尿中提取、精制而成的一种天然促性腺激素，具有类似黄体生成素的功能。绒促性激素是从受精卵着床第1天，即受孕的第8天开始，由胎盘滋养层合体细胞分泌的。受孕后第20天尿中可测得HCG，当妊娠45天时，尿中HCG的浓度升高，60-70天时达到高峰。此后逐渐下降，到妊娠第18周降至最低水平，分娩后4天左右消失。 

临床主要用于男性垂体机能不足所致的性机能过低症和隐睾症，用于由黄体功能不全引起的功能性子宫出血病和习惯性流产。与自孕马血清、绝经期妇女尿中提取的促性激素合用，可诱发排卵，治疗不育症，亦可用于皮肤搔痒症、神经性皮炎等。 

国际上从20年代就开始研究，1927年Zondek和Ascbheim首先发现妊娠妇女尿中存在着促性腺激素，1936年Brown和Venning找到在妊娠第60-80天，尿中绒促性素分泌达到最高峰。1928年Zondek和Ascbheim首先用乙醇沉淀法，从孕妇尿中取得了活性物质，其他研究者则进行应用吸附剂从尿中直接吸附绒促性素的研究，这包括1932年Katzman和Doisy用苯甲酸吸附法，1943年Katzman等人用人造沸石层析吸附法，1954年Loraine和Brown用高岭土吸附法，1959年难波修一等人用离子交换树脂吸附法等，用这些方法所取得的绒促性素再用各种纯化方法进行纯化。 

本发明依据绒促性素是糖蛋白激素，分子中的唾液酸组份对其生物活性免受破坏具有保护作用对这一特点进行攻关，突破了高速冷冻 离心、DEAE吸附分离杂蛋白、高-低盐反抽纯化等技术难点，独创了柱分离、柱平衡提纯技术，在保持“HCG”生物活性稳定条件下，使HCG生物活性提高并稳定在5000iu/mg以上，收率则从47％-50％一举提高到90％以上，并于1999年11月通过青岛市科学技术委员会组织的专家组鉴定。 

发明内容

本发明公开了一种研究柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法，改进原来的洗涤液和洗脱液配比做出的产品杂质多并且在以后的步骤中难以去除的问题，通过增加洗涤液的盐度的方法来去除杂质低盐洗涤，高盐洗脱高效分离，大大提高了HCG的收率和效价。 

在发明的技术方案中，所述HCG制备工艺路线如下： 

1粗制品生产工艺 

尿液检查、吸附、脱附、干燥后的HCG粗品。 

2高盐抽提 

2.1高盐抽提液的配制：0.1mol/L醋酸钠，0.015mol/L无水氯化钙，0.5mol/L氯化钠，加纯化水搅拌溶解，滴加冰醋酸，调pH至5.1；然后加95％乙醇，使乙醇终浓度为50％，搅拌混匀，置8-12℃保存。 

2.2取上述粗制品，加高盐抽提液，在低温8～12℃条件下搅拌，静止过夜；次日虹吸上清液；向渣子内加高盐抽提液，在低温8～12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液；合并二次上清液，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，并继续搅拌30分钟，置低温8～12℃静止过夜；次日，虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用少量工业丙酮洗涤，置离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用工业五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后即为高盐抽提干粉。 

3低盐反抽 

3.1低盐反抽液的配制：0.1mol/L醋酸钠加纯化水搅拌溶解，滴加冰醋酸，调pH至4.8；然后加95％乙醇，使乙醇终浓度为50％，搅拌混合均匀，置8-12℃保存。 

3.2取上述高盐抽提干粉，慢慢加入低盐反抽液，在低温8～12℃条件下搅拌3小时，离心，收集上清液，向渣子内加入低盐反抽液， 在低温8～12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液；合并二次上清液，边搅拌边加预冷至-20℃的95％乙醇，并继续搅拌30分钟，置低温8～12℃静止过夜；次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用适量丙酮脱水，置六罐离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用五氧化二磷作吸水剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后的即为低盐反抽干粉。 

4DEAE吸附