[发明专利]一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其方法，具体涉及一种热稳定性提高的碱性淀粉酶突变体及其制备方法。

背景技术

淀粉酶是最早用于工业生产的酶制剂，是迄今用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。碱性淀粉酶在高pH环境下具有稳定性和活性，因而在工业生产中有较高的应用价值，现已用于纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品等行业。但来源于野生菌株未经改造的碱性淀粉酶在热稳定性等方面存在一定局限性，限制了其应用范围。因此基于已得到的碱性淀粉酶在大肠中的表达平台，利用定点突变，对碱性淀粉酶进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的碱性淀粉酶。

发明内容

本发明提供了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其特征在于，对淀粉酶结构域A、B、C内的一个或多个氨基酸进行替换，提高了淀粉酶的热稳定性。

所述淀粉酶突变体是以SEQ ID NO.1为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合得到的突变体。

能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的载体也属于本专利要求保护的范围。

能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也属于本专利要求保护的范围。

本发明还提供一种制备所述淀粉酶突变体的方法，是将淀粉酶催化部位一个或多个氨基酸通过PCR或化学全合成的方法进行替换。

具体而言，是以SEQ ID NO.1为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合。

所述制备所述淀粉酶突变体的方法，具体步骤如下：

1）根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ(图1)；

2）利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶（SEQ ID NO.1）进行模拟，获得淀粉酶空间结构；

3）通过对淀粉酶的氨基酸序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点；

4）设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；

5）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。

表1淀粉酶突变引物序列

本发明提供的碱性淀粉酶突变体热稳定性显著提高，在50°C的半衰期提高到43.8min，提高了2.9倍。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该碱性淀粉酶突变体应用于纺织、洗涤剂、制革等领域，可以在耐温耐碱环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：pAmyQ的质粒图谱。

具体实施方式

实施例1：淀粉酶热稳定性定点突变分析与方法

通过对淀粉酶序列以及3D空间结构进行分析，确定活性中心与酶的热稳定性提高有关的几个氨基酸残基（Pro 58,His 199,Gln 216,Asn 292,Pro 467）。

根据嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成后，克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ。

针对不同位点的定点突变，设计相对应的定点突变引物（表1）。利用定点突变引物及重组质粒pAmyQ，对淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pAmyQ进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得单点突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得单点突变后的重组淀粉酶。以单点突变后获得的重组质粒为模板进行下一轮的突变，获得组合突变后的重组淀粉酶。

实施例2：淀粉酶热稳定性定点突变分析与方法

DNS法测定碱性淀粉酶酶活