[发明专利]一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种热稳定提高的淀粉酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO.1所示序列为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合得到的突变体。

2.权利要求1所述的淀粉酶突变体，其特征在于第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸。

3.权利要求2所述的淀粉酶突变体，其特征在于还将第467位脯氨酸替换成缬氨酸。

4.权利要求1所述的淀粉酶突变体，其特征在于第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸。

5.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的载体。

6.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系。

7.权利要求1所述淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，将淀粉酶活性位点内的一个或多个氨基酸通过PCR或化学全合成的方法进行替换。

8.权利要求7所述方法，其特征在于，以SEQ ID NO.1为出发序列，通过PCR或化学全合成的方法，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合。

9.权利要求7或8所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒；

2）利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；

3）通过对淀粉酶的序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点；

4）设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；

5）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。

10.权利要求1-4任一所述淀粉酶突变体在纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品领域的应用。