[发明专利]一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵生产DHA的方法，特别涉及一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法。

背景技术

二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid，22:6△4,7,10,13,16,19，简称DHA)俗称“脑黄金”，属于ω-3型多不饱和脂肪酸，具有补脑健脑，预防老年性痴呆症；提高视力，防治近视；预防高血压、动脉硬化、关节炎及治疗癌症等生理功能。因此，DHA作为新一代功能性保健因子具有广阔的市场前景。随着市场需求量的扩大，对DHA品质的要求也越来越高，DHA生产研究逐渐向利用生物技术合成方向发展，传统鱼油来源的DHA已逐渐被藻油DHA所取代。藻油DHA是指通过微生物发酵获得的含有DHA等长链多不饱和脂肪酸的油脂，其中DHA生产菌主要有裂殖壶菌、破囊壶菌、隐甲藻等。

裂殖壶菌又称裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类类藻的海洋真菌，单细胞、球形。细胞累积大量对人体有用的活性物质，如油脂、色素（类胡萝卜素、叶黄素、虾青素）、角鲨烯等，其中总脂肪酸中DHA含量高达35%～45%，且细胞中90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂——甘油三酯形式存在，是DHA的理想生产菌株。

中国专利CN101575584公开一种裂殖弧菌及利用其生产DHA油脂的方法，该方法提供一种从渗透压和元素供应角度优化菌株发酵培养基，并结合流加策略，实现裂殖壶菌高密度发酵，采用传统的发酵方法，从甘油保存种接入摇瓶活化→一级种子液→摇瓶二级种子液→一级种子罐→二级种子罐→发酵，最终细胞干重达到70g/L，油脂含量达31.5g/L，DHA占总脂肪酸含量高于35%。

中国专利CN101519676公开一种采用含微量元素的发酵培养基进行发酵生产DHA的发酵生产工艺，采用传统方法培养菌种裂殖壶菌，即斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养得到发酵用种子液；或菌种经斜面活化培养、然后转接入摇瓶扩大培养、再经一级扩大培养和二级扩大培养后得到发酵用种子液，10T罐发酵95h生物量为53g/L，油脂含量72%，DHA含量50%。而传统的种子培养和发酵方法涉及的发酵级数较多，工艺较繁琐，培养周期长，投资成本高。因此，改进种子制备方式，简化扩种工艺，降低生产成本，有利于DHA的工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供可简化扩种工艺，缩短种子培养和发酵周期，减少投资，节约成本，固料培养基营养丰富，富含多种生长因子，更利于种子的生长，菌种细胞的生长活力强、同步性较好，培养固料种子阶段产生的废水、废渣少，环境污染小的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法。

本发明采用的菌种为裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12，已于2012年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.6843，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编为100101。

本发明包括如下步骤：

1）菌种活化与菌悬液制备：将裂殖壶菌菌种接种于斜面培养基上培养活化，培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液；

在步骤1）中，所述斜面培养基的配方可为：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母粉3～5g/L，海水晶15～20g/L，琼脂粉20g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min；所述培养活化的温度可为25～28℃，培养活化的时间可为2～3天；所述菌悬液的菌体浓度可为1.0～2.5×10⁶个/mL。

2）一级种子制备：将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至固料培养基上培养，制成一级固料种子；或

将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至液体种子培养基，摇瓶培养，制成一级液体种子；

在步骤2）中，所述固料培养基包括固态组分和液体营养液组分，所述固态组分为谷物，含量为250～400g/L，所述谷物可选自米类、麦类和玉米等中的至少一种，所述米类可选自大米、小米、糙米等中的至少一种，所述麦类可选自大麦、小麦、燕麦等中的至少一种；