[发明专利]一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法

权利要求书

1.一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）菌种活化与菌悬液制备：将裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12菌种接种于斜面培养基上培养活化，培养到期斜面加入质量百分数为0.85%的生理盐水洗涤菌体，获得菌悬液；所述裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）KDW-12，已于2012年11月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.6843；

2）一级种子制备：将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至固料培养基上培养，制成一级固料种子；或

将步骤1）获得的菌悬液按质量分数为1%的接种量接种至液体种子培养基，摇瓶培养，制成一级液体种子；

3）二级固料种子的制备：一级固料种子以质量百分数为0.85%的生理盐水根据1:1(W/V)比例洗涤菌体，制成菌悬液；

在无菌条件下：

按质量分数为10%～20%的接种量在固料培养基中接入一级固料种子液；或

按质量分数为8%～15%的接种量在固料培养基中接入一级液体种子，摇动K瓶混合均匀，25～28℃，培养2～3天；

制得二级固料种子；

4）二级固料种子发酵罐扩大培养：二级固料种子加入1:3～5（W/V）无菌水振荡洗下菌体，按质量分数为10%～20%的接种量接种至发酵罐扩大培养，发酵前48h温度控制在25～28℃，利用搅拌转速保持30%～50%的溶氧，48h至发酵结束温度控制在18～22℃，发酵3～5天，通过重量百分比为28%的氨水控制发酵pH6.0～6.5，整个发酵过程自动流加经118℃灭菌25min的浓度为580g/L的葡萄糖溶液控制发酵葡萄糖浓度在4～8g/L；

5）发酵结束后，收集菌体细胞，提取DHA油脂。

2.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤1）中，所述斜面培养基的配方为：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母粉3～5g/L，海水晶15～20g/L，琼脂粉20g/L，pH值6～7，121℃灭菌30min；所述培养活化的温度可为25～28℃，培养活化的时间可为2～3天；所述菌悬液的菌体浓度可为1.0～2.5×10⁶个/mL。

3.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述固料培养基包括固态组分和液体营养液组分，所述固态组分为谷物，含量为250～400g/L，所述谷物可选自米类、麦类和玉米中的至少一种，所述米类可选自大米、小米、糙米等中的至少一种，所述麦类可选自大麦、小麦、燕麦中的至少一种。

4.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述液体营养液组分包括组分1和组分2，所述组分1的组成为：葡萄糖2～5g/L，七水硫酸镁0.2～0.6g/L，磷酸氢二钾1.0～5.0g/L，海盐0.1～0.8g/L，甘氨酸0.2～0.6g/L，苏氨酸1.5～1.8g/L，蛋氨酸2～3.5g/L，苹果酸3～6g/L，加水定容，调节pH值为6～7；所述组分2的组成为：La³⁺10～15mg/L，Ce³⁺1～4mg/L，Sm³⁺2～6mg/L，Nd³⁺8～12mg/L，Mn²⁺0.6～1.2mg/L，Co²⁺0.05～0.1mg/L，生物素0.2～0.6mg/L，浅蓝菌素0.1～0.3mg/L，赤霉素GA2～5mg/L，VB₁₂0.5～1.0mg/L，叶酸0.01～0.05mg/L，余量为水。

5.如权利要求1所述的一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产DHA的方法，其特征在于在步骤2）中，所述固料培养基的制备方法为：固态组分与液体营养液组分1混合均匀，将谷物蒸或煮至谷物中心无白心，且含水率为50%～65%，获得固料培养基原料；将固料培养基原料与液体营养液组分2混合均匀，装于固态发酵K瓶中，厚度0.2～1.0cm，121℃灭菌30min，制得固料培养基。