[发明专利]检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，尤其涉及一种高灵敏性的应用二重PCR扩增技术检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法。

背景技术

柑橘冬生疫霉褐腐病原菌Phytophthora hibernalis Carne具有寄主范围广，为害柑橘生产严重，分布地域广的特点，且都可以带病果实、组织或无性繁殖材料进行远距离传播。我国柑橘种植区域分布广泛，近年来这些病原菌随着引进优质的种子苗木传人我国的几率越来越大。一旦该病传入，将对我国柑橘产业造成极大危害。柑橘冬生疫霉褐腐病原菌引起的柑橘冬生疫霉褐腐病害是在澳大利亚西部的柑橘果实上首次发现的，随后在其他国家和地区也陆续发现。该疫病是侵染柑橘引起的是一种毁灭性病害，侵染初期，果实表皮出现浅褐色变色，感染部位皮质坚硬，湿度适合时长出白色菌丝体。受害果实味苦、具腐臭味。中国的柑橘种植区域广泛，地理气候多样，有适合病害发生的地区，故定殖可能性大。近距离传播方式有风雨、工具等传播途径，远距离传播主要以土壤、果实、繁殖材料进行传播。该病害一直持续困扰着意大利、葡萄牙等地的柑橘生产。

柑橘枝瘤病原菌Sphaeropsis tumefaciens Hedges，主要危害墨西哥酸橙、来檬和大多数的橘科植物。表现枝瘤和丛枝两类症状，但以枝瘤及枝瘤溃疡为主。带病的植物组织可传病原菌。病原菌可借风、雨等近距离传播，带病的植物组织如树枝、病叶以及繁殖材料是远距离传播病原菌的途径。许多柑橘栽培种都对此病敏感，影响极大。2008年5月22日，欧盟食品安全局发布由法国当局完成的关于柑橘有害生物的风险评估报告就包括了该病原菌的评估。

目前针对疫霉属真菌的系统发育已有部分研究，针对柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的分子检测技术也有PCR 检测的报道。2008年，张海峰等比较分析了冬生疫霉和其它疫霉的ITS 序列，在此基础上设计了1 对检测冬生疫霉的特异引物751F/752R，该对引物可从冬生疫霉菌中扩增到一条长616 bp 的DNA条带，而其它19 种疫霉和其它真菌均无扩增条带。其检测限度可达到每25 μL 反应体系只需10 fg 基因组DNA 的水平，但带菌柑橘样品的扩增条带不特别明显。

针对柑橘枝瘤病原菌，目前，柑橘枝瘤病原菌的检测仅见到有使用通用引物ITS4和ITS5进行PCR检测的报道。从NCBI的数据库中搜索，也只有区区2条核糖体序列。因此，PCR引物设计成了难题。

由上可见，柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌是国外的柑橘中常见的两种对柑橘的危害很大的两种病菌，因此提供一种更高灵敏性的同时检测上述两种病菌的检测方法，成了本领域内的研究热点。

发明内容

本发明解决了上述背景技术中的难题，提供了一种基于二重PCR扩增检测柑橘枝瘤病原以及柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，该方法步骤简单、能够有效果的对两种病菌进行检测。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；

（2）、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；

（3）、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。

步骤（1）中所述的PCR缓冲液为10×PCR缓冲液，所加入的去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶之间的体积比为16：2.5：1：1：1：1：1：1 ：0.5，其中正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1以及反义引物SPT2的浓度均为10μM，dNTPs混合物的浓度为2.5 mM each， TaqDNA聚合酶的浓度为5U/μl，目标物DNA的浓度为100-200 ng/μl。

步骤（2）中扩增的程序为：94℃ 3min，94℃ 30S，62℃ 30S，72℃ 30S，循环32-36次，最后72℃补时5min。