[发明专利]利用时间分辨上转换发光检测技术进行磁性结合测定的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用时间分辨上转换发光检测技术进行磁性结合测定的方法，更具体的涉及一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法。

背景技术

磁珠由于可轻易地通过磁场而分离且无需特殊而又昂贵的设备，因而已广泛用作分析物分离和富集的载体，通过在磁珠表面上标记以特异性粘合剂而捕获复杂样品中的欲研究物种（例如蛋白质、核酸（DNA或RNA）、细胞和微生物）。被捕获的物种通过磁铁可轻易地与样品的其余部分分离。随后，被捕获的物种可被裂解，并通过各种手段而从磁珠表面上释放出来。为检测欲研究的物种，标记有另一特异性待测物结合位点的检测探针可在磁性分离前与含待测物样品一同振荡混匀，以使一些探针可通过欲研究的物种而被捕获，形成夹心复合物。在磁珠上的捕获探针随后可与那些剩余的未结合检测探针分离。捕获探针数量取决于探针的性质而可通过各种方式来测量。捕获探针的数量与欲研究物种的数量成正比或反比，由此获得一种用于检测欲研究物种在样品中是否存在及其含量的方法。

一些众所周知的结合测定类型已与磁珠分离技术配合，实现了方便的分析物检测。这些结合测定之一是免疫测定法，它使用标记以可检测成分的免疫反应物，以可对分析物进行分析检测。对于“夹心型”免疫测定，测试样品通常首先与固定在磁珠表面上的抗体混合，以捕获分析物。抗体通常对分析物具有特异性。磁珠随后与样品的其余部分分离，之后与移动和连接到标记或探针的另一抗体混合，例如染色胶乳、胶质金属溶胶、放射性同位素、荧光染料或酶。抗体也对不同表位上的分析物具有特异性。磁珠随后通过磁铁而再次与未结合的标记或探针分离。之后测量与磁珠一同被捕获的标记的信号，且与标准曲线相联系，以获得分析物的数量。这样，由磁性免疫测定可获得一种用于确定物种存在与否的快速简便的技术。在这类测定中，已使用各种信号产生机制，包括颜色（吸收和反射率）、荧光、化学发光法、放射性和酶。

类似地，核酸（DNA和RNA）杂交测定也可与磁性分离配合，实现对样品中DNA和RNA的检测和定量。在磁性DNA/RNA杂交测定中可使用各种信号产生机制，包括颜色（吸收和反射率）、荧光、化学发光法、放射性和酶。

然而，所有这些现有的信号产生机制对于磁性结合测定都存在明显的局限。例如，基于颜色的吸光率检测灵敏度低。大多数商业磁珠呈深色和褐色，会干扰彩色探针的吸光率或反射率的测量。传统的荧光测量会受到大多数复杂生物样品的自发荧光的干扰，且需要很昂贵的仪器。此外，磁珠通常对可激发大多数荧光探针的紫外线或可见激发光具有显著的吸收作用。时间分辨荧光可消除背景荧光和自发荧光的干扰，且成本可以很低。然而，所有适用于时间分辨发光检测的有用探针均需在紫外线附近或短于450nm处被激发，而在此大多数生物样品具有显著的吸收作用。激发光在近紫外线区域中被分析物本身和样品介质吸收，由此显著降低了结果的准确性。短波长的激发光也可因光诱导氧化而损坏分析物。因此，仍需建立一种改进的荧光测量方法。目前在结合测定中需要使用一种便宜、准确而又灵敏的信号检测技术。本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，解决了现有技术中激发光在近紫外线区域中被分析物本身和样品介质吸收而导致显著降低了结果的准确性等问题。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种用于检测分析物在样品中是否存在及其含量的测定方法，其特征在于所述测定方法包括以下步骤：

（1）使含有所述分析物的样品与磁珠结合物、探针结合物接触，其中所述磁珠结合物为磁珠与第一特异性结合部连接形成，所述探针结合物为用来作为标记的检测探针与第二特异性结合部连接而成，所述检测探针在短于激发光波长的波长处发出发光寿命超过5μs的发光，所述第一特异性结合部和所述第二特异性结合部分别与所述分析物的不同表位特异性结合，形成夹心复合物；

（2）使用磁性装置将样品中磁性结合体与所述样品的其余部分分离，其中所述磁性结合体包括所述夹心复合物；

（3）使用在第一波长处的脉冲光源来激发所述分离的磁性结合体，从而在每次脉冲之后的一定延迟后，通过收集和测量在第二波长处的所述发光来获得检测信号，其中所述第二波长短于所述第一波长；

（4）将所述检测信号与校准曲线作比较，从而获得所述样品中所述分析物的数量，其中所述样品中所述分析物的数量与所述检测信号成正比。