[发明专利]四种菌的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）、丙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）和鸡伤寒沙门氏菌（Salmonella gallinarum）的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

沙门氏菌（Salmonella）属肠杆菌科，是人类重要的肠道致病菌，也可在动物肠道中繁殖或引起疾病。目前已知的沙门氏菌有2500多个血清型，我国发现了200多个血清型。沙门氏菌所致的疾病主要有两大类。一类是伤寒和副伤寒，由伤寒或副伤寒沙门氏菌引起，偶见由其他沙门氏菌引起伤寒样的感染，如猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。鸡伤寒沙门氏菌（Salmonella gallinarum）是鸡的重要致病菌，主要引起鸡伤寒（fowl typhoid）。

食品中沙门氏菌的检测主要是依靠传统的培养的方法，该方法需选择性增菌培养、生化鉴定、血清分型，通常要5-6天才能得出检测结果，不利于及时诊断、查找病源，控制病情的蔓延。沙门氏菌的传统方法鉴定需要经过病原的初步分离、生化鉴定并结合血清学分型，然后不同血清型之间发生的交叉反应会干扰血清学诊断的准确性。如肠炎沙门氏菌菌毛蛋白在沙门氏菌D群血清型中仍有编码。用该菌毛蛋白进行的凝集试验常与鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等发生交叉凝集，即使是应用SEFl4菌毛抗原制成的纯化单克隆抗体进行胶乳凝集试验，仍与都柏林沙门氏菌发生交叉反应，从而使传统的检测方法中存在一定比例的假阳性等问题。随着分子生物学技术的发展，已有针对invA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEFl4、sefA、sdf、ssaQ、fimY等为目标基因，用普通PCR或实时荧光PCR检测沙门氏菌的报道，但以上述序列作为目的片段的PCR法，只能检测到一部分Sa血清型或其毒力基因，不能同时得出所检测沙门氏菌属的血清型、毒素分泌类型等。目前也有商业化的杜邦公司生产的Bax系统，该系统利用荧光PCR技术从属的水平上检测沙门氏菌，具有较高的特异性，但不能对沙门氏菌进行分型。Camila等针对ompC、SdfI、ViaB、Spy为目的基因设计引物，建立了多重PCR检测沙门氏菌（Salmonella spp）、SE（Enteritidis）、伤寒Sa（Typhi）、ST（Typhimurium）的方法，应用于鸡肉中的沙门氏菌检测，KIM等也根据鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的特异序列设计多对引物，建立了多重PCR检测鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的方法，均得到较好的效果，但上述方法需通过凝胶电泳判定结果，操作较为繁琐。EdelO'Regan等用flic、sefA、sdf、acek基因设计引物探针，用多重荧光PCR方法检测Enteritidis,Gallinarum,Typhimurium,Kentucky和Dublin沙门氏菌，但sefA为目的基因无法准确区分Enteritidis,Gallinarum和Dublin，flic为目的片段则无法区分Typhimurium和Kentucky，DavidFde等用普通PCR和应该光PCR来检测猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，但该研究也未对荧光PCR扩增体系的扩增效率等进行系统的评价。

因此，建立快速检测猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌的方法，对于食品中沙门氏菌的检测、预防与控制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、可靠、灵敏度高、特异性强的猪霍乱沙门氏菌（SC）、丙型副伤寒沙门氏菌（SP）、伤寒沙门氏菌（ST）、鸡伤寒沙门氏菌（SG）三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次实时荧光PCR扩增就能判断样品是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的污染，再通过单一荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。