[发明专利]一种TMC1耳聋基因突变筛查方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因突变筛查方法，具体涉及一种TMC1耳聋基因突变筛查方法。

背景技术

研究表明，60％耳聋由遗传因素导致，另外40％与环境因素有关。以往由于人们缺乏对耳聋遗传病因学的深入认识以及诊断技术，无法明确耳聋分子病因，更无法预防其发生。近30年来，伴随耳聋遗传病因学及分子生物学技术的快速发展，至今已有84个耳聋基因被克隆，一些常见基因得到了深入的认识，耳聋分子病因学诊断成为可能。虽然欧美自上世纪末开展了耳聋基因诊断工作，但因缺乏对中国耳聋人群致聋遗传因素的系统性研究，并缺乏符合中国国情及遗传背景的耳聋基因筛查及诊断工具，我国临床耳聋基因诊断工作受到严重限制而远远滞后。

TMC1基因突变可以引起常染色体显性及隐性耳聋。如“耳聋相关基因TMC1”(《国际耳鼻喉头颈外科杂志》，2008年第05期)中报道，TMC1基因突变具有常染色体隐性遗传和显性遗传两种遗传方式，相对应出现两种截然不同的听力表型特征，正逐渐为听力学家、遗传学家和耳科学临床工作者所关注。研究表明：TMC1c.1714G＞A(p.D572N)是引起常染色体显性遗传性耳聋的热点突变，近期的研究也在中国发现了携带该突变的耳聋家庭。由于该突变区域缺乏酶切位点，不能进行酶切反应，因此目前国际上检测该突变主要是采用Sanger测序法。此方法成本较高，限制了该突变的大规模人群筛查。

发明目的

有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种TMC1耳聋基因突变筛查方法，该方法简单、快速、经济，解决了TMC1c.1714G＞A(p.D572N)热点难以进行人群大规模筛查的难题。

本发明提供的一种TMC1耳聋突变基因筛查方法，所述方法包括(1)提取外周血白细胞DNA；(2)以外周血白细胞DNA为模板，以

上游引物：TCCTCTAG CCTTCATACACCGAAGTC

下游引物：AACCTGGGAGGCTTTTCTGT

进行PCR扩增，(3)以限制性内切酶Sal 1酶切所述PCR扩增产物，得到160bp，130bp，30bp三条带即为TMC1耳聋基因阳性突变样本。

进一步，酶切所述PCR扩增产物的反应条件为：37℃，4小时。

进一步，所述PCR扩增产物酶切后以2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

进一步，所述PCR扩增产物酶切后以8％聚丙烯凝胶电泳鉴定。

本发明的有益效果在于：

(1)易于实现：本发明技术方法不需要特殊昂贵设备，且能较快定购到实验所需试剂，实验前期准备时间短；

(2)操作简单：按照分子生物学试验室的程序化操作即可完成。

(3)成本低：所引入的限制性内切酶Sal 1是普通常用酶，价格低廉(500U/80元)，每例样品检测需1U，加上凝胶、电泳液、酶切体系的配制，酶切反应成本约为3元/例，而传统的Sanger测序法成本为25元/例。

(4)准确率高：检测结果与Sanger测序法结果完全吻合，无假阴性、假阳性。

(4)解决了难题：鉴于以上优点，该技术可在基层单位广泛开展，解决了TMC1c.1714G＞A(p.D572N)热点难以进行人群大规模筛查的难题。

本发明通过在引物设计中对突变位点上游第三位碱基进行修改，引入了Sal 1酶切位点，修饰了上游引物，采用修改后的引物进行PCR反应，扩增产物可采用酶切法对突变进行鉴定，大大降低了检测成本。

野生型样本(即非突变样本)酶切后为两条带130bp，30bp，杂合突变型样本(即阳性突变样本)为三条带160bp，130bp，30bp，易于对比鉴定。

附图说明：

图1：2％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切扩增产物。

凝胶电泳结果，lane 1，21为PCR产物；lane 2，3，4，6，7，8，9，10，11，12，14，16，17，18，19，20，22，23，24为野生型；lane 5，13，15为突变型

图2：野生型和突变型酶切后的样本琼脂糖凝胶电泳结果判读示意图。

图3：野生型和突变型酶切后的样本Sanger测序验证。

具体实施方式：

实施例1

1、模板DNA：提取自外周血白细胞中DNA，

2、PCR反应体系

3、PCR循环参数