[发明专利]山葡萄黑龙江实生抗寒相关基因VaERD15的克隆

说明书

一、技术领域

本发明属植物生物技术领域或果树作物育种领域，特别涉及到山葡萄黑龙江实生编码早期脱水应答基因的克隆及其表达载体的构建。

二、背景技术

我国葡萄的栽培面积及产量均居世界前列，广泛应用于鲜食、酿酒、制汁、制干等方面。生产上栽培的葡萄品种多属于欧亚种，品质优良但抗寒性差。无论是冬季冻害还是解除休眠后的冷害，都会对树体造成伤害，带来巨大的经济损失。寒害是葡萄生产上普遍存在的突出问题，在受到环境胁迫时，通过信号传导途径有效地调控体内相关功能基因的表达，进而引发一系列生理、生化反应，形成高效有序的信号调控网络，以降低或消除逆境胁迫给树体带来的危害。中国是葡萄属植物的原产地之一，从黑龙江到海南岛都有野生葡萄的分布，资源十分丰富，抗病、抗逆性强。其中，山葡萄（Vitis amurensis）是葡萄属植物中最抗寒的种，是极为重要的抗寒基因资源。因此，利用野生葡萄资源的抗寒性，将抗寒基因通过转基因手段转入欧亚种葡萄中以培育抗寒葡萄新品种是解决生产问题的有效途径。

ERD是一种可以快速应答逆境胁迫的基因，除了具有快速应答干旱胁迫的特征，还具有应答寒冷、盐、衰老、ABA等多种逆境胁迫信号的特征。迄今已有16个ERD基因在在拟南芥中发现，这些基因作用于不同的代谢途径，分别通过感知并传递信号胁迫，产生功能蛋白，参与重要的代谢反应，通过降解毒素等不同的方式来增强拟南芥对水分胁迫的抗性等功能。拟南芥ERDl5编码一个小的酸性蛋白，其表达可以被干旱、低温、高盐、机械创伤、ABA、SA和植物病原菌等多种胁迫瞬时诱导。该基因快速的对多种生物胁迫和非生物胁迫的应答表明它可能在植物的各种逆境胁迫中起重要作用。该基因可能是一个多种信号调控的中转站，在响应多种生物和非生物胁迫中发挥重要作用。本发明从提高抗寒相关基因在葡萄中的表达来研究如何提高葡萄的抗寒性，并通过基因克隆及其表达来研究相关基因在植物体内的作用。

三、发明内容

本发明的目的在于，提供了山葡萄（Vitis amurensis）黑龙江实生早期脱水应答反应基因VaERD序列及相应的氨基酸序列及其在改良植物抗寒性方面的应用。

为了实现上述目的，本发明采用实时定量PCR侧顶部不同部位VaERD基因的表达量，并提供含有VaERD的克隆载体pC/VaERD。利用本发明成果，可以构建早期脱水应答基因VaERD基因工程菌，用于植物的转化，达到改善植物抗性的目的。

本发明的主要步骤包括：以山葡萄黑龙江实生为植物材料，提取植物总RNA，反转录成cDNA，利用生物软件设计引物，通过简并PCR和RACE的方法获得了VaERD早期脱水应答反应基因全长cDNA序列，将克隆的黑龙江实生早期脱水应答反应基因VaERD与GUS报告基因融合，在黑龙江实生中进行了低温诱导表达，证明该基因具寒胁迫调控的特性，并以pC3301为基础构建了植物表达载体。

四、附图说明

图1总RNA电泳图

图2目的基因RACE电泳图

图3目的基因全长电泳图

图4目的基因全长核苷酸及编码蛋白序列

图5VaERD基因受低温诱导后在根中不同诱导时间下的表达

图6VaERD基因受低温诱导后在茎中不同诱导时间下的表达

图7VaERD基因受低温诱导后在叶中不同诱导时间下的表达

图8VaERD基因载体构建图

图9VaERD基因载体构建酶切检测图

五、具体实施方式

1.采用改进SDS/酚法(果树学报，张今今等2003，20（3）：178-181)，以4℃冷处理0，2，6，12，24，48小时的黑龙江实生叶片、嫩茎及须根为试材，提取、分离、纯化核糖核酸（RNA）；

2.将上述黑龙江实生的总RNA等量混合物的反转录产物为模板，设计GSP引物进行RACE扩增。

VaERD-3:5’-GTTCGTTCCGTTGGCATATCGGACGGT-3’

VaERD-5：5’-CTCAAACTACCAGGAAACCCTAACTCGC-3’。

2.1目的基因的5'-RACE扩增

2.1.1First-Strand cDNA的合成

A.在0.2ml薄壁PCR管中加入如下试剂：

RNA Sample             3μL

5’-CDS Primer         1μL

SMART II A oligo       1μL