[发明专利]一种利用喜树AOC基因转化提高烟草抗冻性能的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法。

背景技术

茉莉酸类物质是植物界中普遍存在的一种激素，参与植物发育和逆境胁迫下应激反应的信号传导过程。内源和外源的茉莉酸类化合物能显著提高植物对机械损伤、动物撕咬、病虫害侵染、低温、高盐等不利外界环境的耐受能力。在植物中，茉莉酸类物质的合成途径是从细胞膜上释放的亚麻酸开始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化酶、OPDA（12-oxo-(10,15Z)-phytodienoic acid）还原酶、β-氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物会自发水解，由此丙二烯氧化物环化酶的作用在茉莉酸类物质的合成途径中尤为重要。

作为一种重要的模式植物，且易于进行遗传转化，烟草是植物的信号途径研究中的热门对象；作为一种广泛种植的经济作物，烟草的抗逆性能在物种品质和经济价值上具有非常重要的意义。烟草的抗冻研究目前涉及β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)蛋白，超氧物岐化酶(SOD)蛋白等。

相比较而言，利用来源于喜树的茉莉酸类物质合成途径的关键酶丙二烯氧化物环化酶的基因工程来系统性地提高烟草的抗冻性能具有很大的优势：（1）在茉莉酸类物质的合成和信号传导研究领域，全世界的研究人员已经进行了几十年的深入研究，其生理作用和生化机制比较清楚，为在基因工程中利用茉莉酸类物质生物合成途径的基因打下了良好的理论和实践基础。（2）提供一种全新的思路，采用转aoc基因提高烟草抗冻性能的方法。喜树是一种和烟草亲缘关系比较远的植物，来源于喜树的丙二烯氧化物环化酶在烟草中能顺利表达并达到高活性效果，提高了尼古丁含量。这为开展植物基因工程研究提供了一个新的方向。

目前，尚未有任何与本专利申请中所提及的应用基因工程技术把喜树的茉莉酸物质生物合成途径的酶基因尤其是丙二烯氧化物环化酶转到烟草中，提高烟草抗冻性能的相关报道，包括专利和文献。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种利用基因工程技术提高烟草抗冻性能的方法，该方法将来源于喜树的丙二烯氧化物环化酶基因转到烟草中。

本发明的第二目的是提供一种高效表达载体，它包含上述喜树的丙二烯氧化物环化酶基因片断。

本发明的第三目的是提供一种用上述高效表达载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草。

本方法的技术方案如下：

本发明分离出的DNA分子，具有编码丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断，该核心片断来源于由申请人在GenBank中登录的喜树（Camptotheca acuminate）丙二烯氧化物环化酶基因（登录号AY863428）的核苷酸序列，用引物P1（5'-gg actagt Atg gct gct tca tca act tc-3', SpeI酶切位点用下划线表示）和P2（5'-ga ggttacc Tca gtc agt gaa gtt agg aa-3', BstEII酶切位点用下划线表示），采用PCR法可以从喜树cDNA文库中扩增出该核心片断，喜树丙二烯氧化物环化酶基因的cDNA序列见SEQ ID NO：1，其全长1129bp，开放阅读框位置为第72位碱基到第812位碱基。

本发明提出的利用转基因技术提高烟草抗冻能力的方法，是利用具有编码喜树丙二烯氧化物环化酶（AOC）的核苷酸序列（Genbank No.:AY863428）的植物表达载体，采用转基因方法在烟草细胞、组织、器官、植株中过量表达喜树丙二烯氧化物环化酶基因的DNA分子。

其具体步骤如下：

（1）采用任何可能的手段（如基因克隆、人工合成基因等方法）获得喜树丙二烯氧化物环化酶基因的核心片断；

（2）把喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断可操作地连于表达调控序列，形成表达载体；

（3）采用任何转基因方法转移喜树丙二烯氧化物环化酶基因核心片断到烟草细胞、组织、器官、植株中；

（4）在特定的条件下筛选和鉴定转化子；

（5）在适合的条件下培养抗冻性能提高的烟草转化子，获得转基因后代。

本发明涉及的载体包含具有编码喜树丙二烯氧化物环化酶的核苷酸序列的核心片断的DNA。

用上述方法获得的生命体，它是抗冻性能提高了的烟草的细胞、组织、器官、植株。