[发明专利]一种闹羊花毒素Ⅲ单体的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，具体涉及从羊踯躅中提取分离闹羊花毒素Ⅲ单体的方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。

背景技术

闹羊花毒素Ⅲ又叫闹羊花素Ⅲ，Rhodojaponin一Ⅲ，分子式为C₂₀H₃₂O₆，分子量为368，结构式如下：

闹羊花毒素Ⅲ来源于杜鹃花科植物羊踯躅Rhododendron molle G. Don，是羊踯躅药材中的主要活性成分和特征成分，闹羊花素Ⅲ为植物源杀虫剂，其杀虫作用机理主要有两方面，一是作用于神经系统，影响神经细胞三磷酸腺苷(ATP)酶活性，阻断神经传导，影响离子通道开放；另外是破坏中肠生物膜系统，影响消化道酶系和解毒梅系活性。作用方式主要为拒食和胃毒作用、产卵忌避作用，兼有触杀作用。

根据相关检索得知，目前对于闹羊花毒素Ⅲ单体的分离，主要是采用经硅胶柱层析后再反复结晶的方法，其生产周期长，得率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便的快速分离制备高含量闹羊花毒素Ⅲ的方法，为新药研发和药材质量评价提供支持。该方法操作简便，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量闹羊花毒素Ⅲ单体的高纯度分离制备，得到的闹羊花毒素Ⅲ单体纯度高，可达到98%以上。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种闹羊花毒素Ⅲ单体的分离纯化方法，其特征在于：以杜鹃花科植物羊踯躅药材为原料，通过提取、萃取、制备液相系统分离及干燥得闹羊花毒素Ⅲ单体，具体包括如下工艺步骤：

A 提取

将干燥的羊踯躅药材粉碎成1～4mm的粗粉，加入醇溶液，于60～100℃提取3～5次，每次1～3小时，提取液过滤，合并过滤液，60～90℃浓缩回收乙醇，得相对密度1.0～1.1的浓浸膏。

所述醇溶液为甲醇或乙醇溶液，它们的浓度均为G/G=70～90%。

所述醇溶液的加入量为药材重量:醇溶液体积=1Kg:(6～10)L。

通过粉碎、加热提取、减压浓缩，将目标物转移至浸膏中更利于后续处理。

B 萃取总毒素

将步骤A所得的浓浸膏加水稀释至60℃时相对密度为0.7～0.9g/mL，然后加入等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，分取上层溶液，45～60℃减压浓缩至干，所得固体物用质量/体积=10～15的甲醇超声溶解，并用0.45μm有机膜过滤，得澄清溶液。

通过乙酸乙酯萃取、甲醇溶解、有机滤膜过滤，可进一步有效除去大部分杂质，纯化了闹羊花毒素Ⅲ。

C 通过制备型高效液相色谱分离闹羊花毒素Ⅲ单体

取步骤B所得的滤液进样，进行闹羊花毒素Ⅲ单体的制备分离，紫外检测器在线监测针对性收集闹羊花毒素Ⅲ的制备馏分溶液，得闹羊花毒素Ⅲ单体溶液。

所述制备型高效液相色谱采用填料为C₁₈的色谱柱、流动相组成为：体积分数65～85%的甲醇水溶液。

所述紫外检测器检测波长为210nm。

本发明在进行高效制备液相色谱分离前，可通过液-质联用或其它本技术领域常用的方法，如核磁共振碳谱、氢谱等确定高效液相色谱中闹羊花毒素Ⅲ单体的峰形。

以液-质联用（HPLC-MS）方法为例，可采用填料为C₁₈的色谱柱，流动相组成为：体积分数65～85%的甲醇水溶液，柱温为室温，检测波长为210nm，取步骤B所得的澄清透明滤液适量进样，进行闹羊花毒素Ⅲ单体的HPLC-MS检测，紫外检测器在线监测，并根据质谱正离子检测结果，确定闹羊花毒素Ⅲ单体在液相色谱中所对应的峰形及归属。由于制备型高效液相色谱分离闹羊花毒素Ⅲ单体也采用C₁₈色谱柱，且流动相组成相同，因而可用于推断在制备型高效液相色谱中闹羊花毒素Ⅲ单体的出峰位置及峰形等。

D 干燥制备闹羊花毒素Ⅲ单体产品

取步骤D所得闹羊花毒素Ⅲ单体溶液，于45℃～75℃减压浓缩至干，再将固体物于45～85℃与另器盛放的五氧化二磷共存，真空干燥至恒重，收集干品，即得闹羊花毒素Ⅲ单体产品。

本发明的优点在于：

1、本发明通过步骤B的乙酸乙酯萃取、甲醇溶解、有机滤膜过滤，进一步有效除去了大部分杂质，纯化了闹羊花毒素Ⅲ。