[发明专利]日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及反向遗传学技术和RNA病毒拯救技术，具体地说，涉及日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆、其构建方法及应用。 

背景技术

黄热病毒属病毒属于正链RNA病毒，该属包含80多个成员，其中过半数以上的病毒能够诱发人和动物产生疾病，患病率高而治愈率差，容易留下一些严重的后遗症，给人类健康带来很大威胁（Monath TP，1996）,如JEV、登革热病病毒(DEN)、黄热病毒(YFV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)等。长期以来，其相关疫苗的研制、药物的开发进展都非常缓慢，到目前为止，仅YFV、JEV、TBEV有疫苗问世，而其他大部分的成员尚无有效的预防和治疗手段。 

流行性乙型脑炎（JE）是亚洲最常见的一种病毒性脑炎，我国是乙脑发病人数最多的国家，占世界总发病数的80%以上，除新疆、西藏、青海外，其他各地区均有发病病例，至今每年仍有几千例病人，对居民健康造成极大的危害，被卫生部列为乙类传染病。尽管大部分人在JEV感染后没有明显的症状发生，但是也有一部分患者能够出现永久的神经性疾病，甚至是致死性疾病，同时超过一半的幸存者会有持久的神经性后遗症。(Vaughn and Hoke,1992;Halstead andJacobson,2003)。目前，针对该病尚无特殊的治疗方法，对蚊虫的传播控制和对易感人群的免疫接种是目前主要的控制手段。 

SA14-14-2株是目前在中国广泛使用的乙脑减毒活疫苗，由中国食品药品检定研究院疫苗一室开发研制，1989年在我国开始接种，截止到2005年，在我国累计接种人数超过2亿人次，该疫苗有效的接种使得我国乙脑患病率从1990年的2.5×10^-3%降低到2004年、2005年间的0.5×10^-3%以下，经过20多年的实践，其安全性和免疫效果已经得到充分的证实，疫苗株遗传稳定性很好，对神经系统毒力减弱，可以对异源性乙脑病毒提供广谱免疫力。 

利用已有的安全有效的疫苗株，制备和其他病原体的嵌合病毒是一种构建新型疫苗的方法（Chamber TJ,1999;Pletnev AG,1992），其主要原理是利用稳定的 减毒株作为受体株，嵌合进供体株相应的编码抗原基因，这样得到的嵌合病毒株既保留有一定的减毒特性，还具有供体株的免疫原性。嵌合病毒疫苗株属于减毒活疫苗，与亚单位疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗等相比更为有效，因为活疫苗能够在宿主体内有效的复制，和自然感染一样，产生一系列不同形式的抗原，诱导细胞因子和免疫反应的产生，细胞内复制能够产生长效记忆功能的T细胞以及很强的CTLs反应，免疫力持久而有效。 

已知通过反向遗传学技术，黄热病毒属中许多病毒的感染性克隆已经获得构建，传统的RNA病毒感染性克隆一般是指细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝,该cDNA经过体外转录后所得的RNA具有感染性。该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子(RiceCM,1989)，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒，由于这种拯救病毒是来自全长cDNA分子,因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,使得在基因水平上对黄热病毒基因组进行操作，改造病毒基因组成为现实。 

如上所述，传统的黄热病毒感染性克隆在获得重组病毒前，必须经历体外转录这一个步骤，以RNA形式转染细胞或者是体内接种敏感动物，由于体外转录过程中RNA产物的均质性得不到保障，加上RNA本身的不稳定性，严重影响着通过人工构建的感染性克隆获得均一的重组病毒颗粒的成功率，传统的RNA病毒感染性克隆在操作中不可避免遇见的这些问题也成为这些克隆实际应用中的障碍。