[发明专利]虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法。

背景技术

虾类是我国水产养殖结构调整、农民增产增收、国家出口创汇的重要农产品。但是，近年来，虾类的养殖频繁出现大面积发病和死亡，造成严重的经济损失。虾类免疫学研究可了解虾类机体的免疫反应特征，从而为虾类的营养免疫和疾病防治奠定理论基础和科学依据。

近年来，多种虾类的一氧化氮合酶基因序列相继被克隆得到，研究认为一氧化氮在虾类的免疫防御中也起着重要的抗菌杀菌的作用。目前，测定一氧化氮含量的最常用的方法是应用Griess试剂测定亚硝酸盐和硝酸盐的含量，从而推算一氧化氮的含量。该方法具有以下明显的缺点和不足：1、机体内并不是所有的亚硝酸盐和硝酸盐都来源于一氧化氮的转化，重复性较差；2、该方法测定的是组织水平的总体含量，不能反映单个细胞水平的含量；3、该方法难以分析不同类型细胞的一氧化氮含量。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速测定虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，该方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成损伤，具有准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速的特点，可同时分析不同类型血细胞的一氧化氮含量。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：

（1）制备虾血细胞悬液；

（2）荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育；

（3）利用流式细胞仪测定虾总血细胞或不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。

步骤（1）所述的制备虾血细胞悬液是将虾体表水分擦干，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，再用预冷的抗凝剂调整细胞浓度后得到虾血细胞悬液；

所述的抗凝剂由以下方法制备得到：蒸馏水中加入葡萄糖20.5g/L，柠檬酸钠8g/L，氯化钠4.2g/L，调整pH至7.5，高压灭菌后得到。

所述的虾血细胞悬液，其中血细胞浓度的数量级优选10⁶cells/ml。

步骤（2）所述的加入荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育，是往取血细胞悬液加入终浓度为10μmol/L的DAF-FM DA，室温下避光孵育60min，用200目筛网过滤；

步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾总血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光（FSC）、侧向角散射光（SSC）和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，同时在FL1-H直方图中获取血细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析血细胞的DAF-FM平均荧光强度。

步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光（FSC）、侧向角散射光（SSC）和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上分别圈定不同类型的血细胞（透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞），建立三个FL1-H直方图，同时在三个FL1-H直方图中分别获取透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。

本发明的原理是：DAF-FM DA与细胞共孵育后能自由穿过细胞膜，进入细胞后被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM，DAF-FM仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以产生强烈的绿色荧光，因此细胞内的DAF-FM绿色荧光强度与一氧化氮含量成正比，利用流式细胞仪测定细胞的DAF-FM平均荧光强度即可反映细胞的一氧化氮含量。在FSC-H/SSC-H散点图中圈定不同类型的细胞，还可分析不同类型细胞的一氧化氮含量。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的方法无需进行细胞洗涤，避免对血细胞造成操作损伤，准确性高、重复性好、测定量大、操作简便快速，可同时分析不同类型细胞的一氧化氮含量，为虾类血细胞一氧化氮含量的测定提供了方法依据。

附图说明

图1是实施例1中斑节对虾血细胞FSC-H/SSC-H散点图。

图2是实施例1中斑节对虾总血细胞FL1-H直方图。