[发明专利]虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法

权利要求书

1.虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备虾血细胞悬液；

（2）荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育；

（3）利用流式细胞仪测定虾总血细胞或不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。

2.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的制备虾血细胞悬液是将虾体表水分擦干，用预先抽取了灭菌预冷抗凝剂的无菌注射器，从虾的围心腔或腹血窦抽取与抗凝剂等体积的血淋巴，再用预冷的抗凝剂调整细胞浓度后得到虾血细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：所述的抗凝剂由以下方法制备得到：蒸馏水中加入葡萄糖20.5g/L，柠檬酸钠8g/L，氯化钠4.2g/L，调整pH至7.5，高压灭菌后得到。

4.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：所述的虾血细胞悬液，其中血细胞浓度的数量级为10⁶cells/ml。

5.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的加入荧光染料DAF-FM DA与血细胞共孵育，是往取血细胞悬液加入终浓度为10μmol/L的DAF-FM DA，室温下避光孵育60min，用200目筛网过滤。

6.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾总血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光、侧向角散射光和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上圈定血细胞，同时在FL1-H直方图中获取血细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析血细胞的DAF-FM平均荧光强度。

7.根据权利要求1所述的虾类血细胞一氧化氮含量的流式细胞术检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的利用流式细胞仪测定虾不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度，是这样操作的：进行上样，调整并确定仪器前向角散射光、侧向角散射光和FL1基本参数，FSC采用Line线性形式，SSC和FL1采用Log对数形式，在FSC-H/SSC-H散点图上分别圈定不同类型的血细胞，建立若干个FL1-H直方图，同时在不同的FL1-H直方图中分别获取不同类型的血细胞的DAF-FM绿色荧光，读取细胞10000个以上，用软件分析不同类型血细胞的DAF-FM平均荧光强度。