[发明专利]热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用及其表达系统和重组表达载体

说明书

 

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用，还涉及含有热休克蛋白基因启动子的表达系统和重组表达载体。

背景技术

RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由dsRNA介导的、特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达，该机制是真核生物体抵抗外源基因（如病毒基因、转座子、人工转入基因等）入侵的一种保护性反应，也是生物体在不同时期通过调控基因表达来调节细胞分化的机制。1999年，Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现，21-25nt的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要，同时指出RNAi作用是由部分纯化的核酸酶中所含的siRNA介导的。Zamore 等用dsRNA转染未经dsRNA处理过的果蝇胚胎细胞的提取物，结果发现：只有在特异性dsRNA存在的条件下mRNA才被降解，而且断裂的位置仅限于dsRNA的相应序列，进一步证明mRNA的断裂是以siRNA为模板。Small interfering RNA（siRNA）是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase ó家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。siRNA是siRISC的主要成员，具有介导与之互补的目标mRNA降解的作用。siRNA的产生主要通过两种手段，一是直接合成RNA片段，另一种是通过载体复制得到的，也是现阶段应用最广的方法。但以往构建的大多数siRNA载体不能在沉寂目的基因的表达量上进行调控，因此在应用siRNA技术研究一些特定基因如与细胞生长、发生、发展密切相关的基因时，由于不能精细调控抑制目的基因的表达程度可能同时会影响正常细胞的生长与增殖。因此可调控、可诱导系统被认为是未来RNAi的重要发展方向。诱导型siRNA可以通过诱导物来调节RNAi系统，从而实现目的基因的定量诱导表达抑制。目前应用的诱导体系有cre2loxP系统，四环素诱导体系，蜕皮素诱导体系和乳糖诱导体系。应用最多的诱导剂有四环素、蜕皮素类。目前诱导型RNAi 技术已应用到肿瘤基因治疗的相关研究中，如结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症的细胞体外研究和实验动物的体内研究已经卓有成效，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。但是当前的可调控系统主要存在以下2种缺陷：（1）免疫反应：调控元件一般会生成蛋白类反应因子，在体内触发宿主                                               型主要组织相容性抗原复合物（MHC-）介导的免疫反应，Ginhoux等在rtTA上发现CD8+特异性抗原簇，激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）导致rtTA表达阳性靶细胞的裂解；（2）漏表达（leaky expression）即在调控抑制状态下存在不同程度目的基因的表达，形成背景噪音。由于哺乳动物的基因系统是复杂的多级、多途径环路，基础表达不可避免。

发明内容

本发明的目的之一在于提供热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用，不表达多余的蛋白类反应因子，避免了调控蛋白在机体中发生免疫反应，同时调控精确，不存在漏表达。

为实现上述发明目的，技术方案为：

热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用。

优选的，所述热休克蛋白基因启动子如SEQ ID NO.3中第9-347位所示的核苷酸序列。

优选的，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的目的之二在于提供含有热休克蛋白基因启动子的siRNA表达系统，能够用于表达siRNA，技术方案为：

含有所述热休克蛋白基因启动子的siRNA表达系统。

优选的，所述热休克蛋白基因启动子如SEQ ID NO.3中第9-347位所示的核苷酸序列。

优选的，所述热休克蛋白基因启动子的3’端还含有内含子剪切位点保守序列。

更优选的，所述内含子剪切位点保守序列的核苷酸序列为actagtac（Nn）ctgctagc；

其中N表示任意碱基，n表示任意数字。

更优选的，所述内含子剪切位点保守序列的核苷酸序列为actagtacctcgagcggggggtaccctgctagc。

本发明的目的之三在于提供含有所述热休克蛋白基因启动子重组载体，受热调控灵敏，43℃条件下能够诱导热休克蛋白基因启动子下游基因表达，技术方案为：

含有所述热休克蛋白基因启动子重组表达载体。