[发明专利]肿瘤细胞识别探针、检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测肿瘤细胞的识别探针；及使用所述识别探针进行肿瘤细胞检测的方法；和用于所述检测方法的试剂盒。

背景技术

由于环境污染、不良生活方式等多种因素的影响，目前肿瘤的发病率越来越高，而且逐渐呈现年轻化的趋势，严重威胁人类生命安全和健康。分子生物学及临床研究表明，肿瘤的侵袭和微转移在肿瘤发生的早期已经出现。

目前传统的肿瘤诊断方法主要依靠肿瘤组织和肿瘤细胞的形态学特征进行判断，需要对具有一定体积的肿瘤组织进行取样检测，无法实现在肿瘤细胞数量很少时检测其存在，即无法实现肿瘤的早期发现；此方法也无法判断肿瘤的转移或复发，更难以及时反映肿瘤治疗过程中的疗效。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是自发或因诊疗操作，由实体瘤或转移病灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发或远处转移的重要标志。CTCs的检测有助于早期发现肿瘤的微转移、监测术后复发、评估疗效及预后或选择合适的个体化治疗。因此对肿瘤组织中肿瘤细胞的检测和对循环系统中肿瘤细胞的检测具有重要的意义。

随着分子生物学、肿瘤医学、分子工程技术和生物纳米技术的不断发展和交叉融合，一系列新型的分子探针被开发应用到肿瘤细胞的检测中，为肿瘤的早期诊断和术后复发诊断带来了新契机。现有技术中出现的探针主要包括以下几种。

第一种为基于抗原-抗体反应的识别探针，利用肿瘤发生发展过程中新出现或过度表达的抗原物质刺激免疫系统产生特异性抗体，肿瘤抗原物质主要是上皮细胞角蛋白、上皮细胞膜特异性抗原和肿瘤相关糖蛋白三类。以特异性的抗体作为探针，与上述抗原特异性结合进行检测，利用这种探针进行检测的缺点是制备过程复杂，需要对抗原进行纯化。

第二种为基于受体配体作用的识别探针，肿瘤细胞相对于正常细胞会表达出一些额外的受体因子，利用肿瘤细胞特有的表面受体作为靶向位点，将配体作为识别探针，实现对肿瘤细胞的检测及成像。利用这种探针进行检测的缺点是需要了解肿瘤细胞到底产生了哪些特异性的突变，配体探针通常为叶酸物质，特异性较低。

第三种为核酸适体探针，核酸适体（Aptamer）是一种DNA或RNA单链，通常由10-40个碱基组成，不同序列的核酸适体能特异性地与不同目标物结合。核酸适体的识别基础如下：当目标物存在时，单链DNA或RNA通过G-C碱基配对、A-U碱基配对、G-U碱基配对而形成一些稳定的二级结构，与靶分子通过氢键、输水堆积作用、范德华力和形状匹配等产生高特异性的结合力，形成稳定的复合物。

核酸适体是由一种指数富集的配基系统性进化（SELEX）方法筛选而来，其目标物可以是小分子、蛋白质、金属离子或特性细胞等。可将特定的肿瘤细胞作为目标物进行核酸适体的筛选（Cell-SELEX），无需了解肿瘤细胞产生了哪些特异性变化，也无需对抗原分子进行纯化，还保证了细胞表面原有构型状态下的结合效果。

现有技术中利用核酸适体检测肿瘤细胞采用将核酸适体交联在玻片等基片上固定，检测灵敏度低。

发明内容

本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种肿瘤细胞识别探针，长度大于等于70bp，包括与肿瘤细胞特异性结合的核酸适体及位于所述核酸适体5’端或3’端的延长序列，所述延长序列为一段自身不会形成二级结构的单链核苷酸序列。

优选地，所述识别探针长度为80-100bp。

优选地，所述核酸适体为肺癌A549细胞核酸适体S11e。

优选地，所述识别探针具有序列表中SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所述核苷酸序列。

本发明还提供了一种肿瘤细胞检测方法，包括：

将所述肿瘤细胞识别探针与待测肿瘤细胞混合孵育，除去未与肿瘤细胞结合的游离识别探针，再进行细胞裂解，提取裂解液；

以所述识别探针延长序列为模版对裂解液进行实时荧光定量PCR，得到达到荧光强度阈值时的特征扩增循环数；

产生表示识别探针初始浓度与达到荧光强度阈值时的特征扩增循环数之间的相关性的函数；

利用所述函数计算裂解液中识别探针初始浓度，即与肿瘤细胞结合的识别探针的浓度。

本发明还提供了一种肿瘤细胞定量测定方法，包括：

将已知浓度的肿瘤细胞稀释成不同的浓度作为标准细胞样品；

用上述肿瘤细胞检测方法检测标准细胞样品结合识别探针的浓度；

产生表示肿瘤细胞浓度和与肿瘤细胞结合的识别探针浓度之间的相关性函数；