[发明专利]一种18O在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台及其操作方法，¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台是一种集蛋白质在线酶解，¹⁸O在线标记，多肽分离，检测为一体的系统。

背景技术：

蛋白质组学起步阶段蛋白质混合物主要分离技术是二维凝胶电泳（2DE），通过第一维等电聚焦电泳和第二维尺寸排阻电泳使蛋白混合物充分分离，然后通过考马斯亮蓝染色或银染使分离在凝胶上面的蛋白显色，显色强度代表样品中对应蛋白含量。通过比较两个样品在二维凝胶电泳中相同位置蛋白显色强度就可以得到对应蛋白在两个样品中的相对含量，同时同一块凝胶上不同蛋白点的强度也粗略代表不同蛋白质在同一个样品中相对丰度。但是二维凝胶电泳操作步骤多，重现性差，不能分析极酸极碱性蛋白、膜蛋白；另外在生物样品中蛋白含量具有很宽动态范围（跨越7-12个数量级，如血清样品），而二维凝胶电泳只能显色大部分高丰度蛋白。随着“shotgun”蛋白质组学技术发展，二维凝胶电泳定量已经逐渐被各种基于液相色谱分离质谱检测的高通量、高灵敏度定量方法所取代。

同位素标记定量是现阶段应用最为广泛的蛋白质组学定量方法，主要包括二甲基标记，18O标记，体内同位素标记（SILAC），iTRAQ标记等等。其中18O标记由于标记试剂相对便宜；可以对体液、细胞、组织等各类样品进行标记；在酶解的同时进行标记，无需引入额外标记步骤等诸多优势而得到了较广泛的应用。目前，限制这种方法进一步推广的原因主要有如下两点：1、¹⁸O标记效率较低：¹⁸O标记主要分为一步法和两步法，一步法操作较简单，只需将样品溶在¹⁸O的溶液中进行酶解即可，但此种方法标记效率很低；两步法标记效率相对一步法高，但操作繁琐耗时，需先将样品在¹⁶O的溶液中进行酶解，酶解后除盐蒸干，蒸干后的肽段再溶于¹⁸O的溶液中孵育。2、¹⁸O标记存在回交问题，即采用传统方法进行¹⁸O标记后，由于蛋白酶仍存在于溶液中，一旦碰到¹⁶O的溶液，标记上¹⁸O的肽段又会回交为¹⁶O（Journal of Proteome Research 2009,8,2140-2143；Journal ofProteome Research 2009,8,2157-2163）。

针对¹⁸O标记存在的上述问题，我们构建了一种集蛋白质在线酶解、¹⁸O在线标记、多肽分离、检测于一体的分析系统。该系统通过将包含酶反应器的在线分析平台与¹⁸O标记有机结合，实现蛋白质在线酶解、¹⁸O在线标记、多肽分离以及检测的快速定量分析，在蛋白质组学研究中具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种集蛋白质在线酶解、¹⁸O在线标记、多肽分离、检测于一体的系统。该系统可以快速的进行¹⁸O在线标记，避免了传统的离线标记方法所带来的操作繁琐耗时、标记效率低、存在回交等问题。为了实现该目的，本发明的技术方案是：

一种¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台，

¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台的构建：进样针与注射泵传动连接，由注射泵驱动进样针向酶反应器内进样；酶反应器置于一柱温箱内，酶反应器的样口入口与进样针相连，酶反应器的样口出口接第一四通或六通阀的第一接口；二台液相色谱泵的物料入口分别与两个流动相储罐相连，二台液相色谱泵的物料出口分别与一个混合器的入口相连，混合器的出口接第一四通或六通阀的第二接口；肽段捕集柱入口端与三通的第一接口相连，三通的第二接口与第一四通或六通阀的第三接口相连，三通的第三接口与第二四通或六通阀的第一接口相连；第一四通或六通阀的第四接口接废液收集容器；肽段捕集柱的出口端与四通的第一接口相连，四通的第二接口与第二四通或六通阀的第二接口相连，第二四通或六通阀的第三接口和第四接口接废液收集容器；四通的第三接口接高压加电金属针；四通的第四接口与多肽分离柱的入口端相连，多肽分离柱的出口端与质谱检测器的进样口相连。

所述¹⁸O在线标记的蛋白质定量分析平台将蛋白酶解部件、¹⁸O在线标记、多肽分离部件、检测器集成化。