[发明专利]单分散聚甲基丙烯酸酯强阴离子交换层析介质在达托霉素纯化中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及药物纯化领域，特别是一种达托霉素的纯化方法。

背景技术

达托霉素(Daptomycin)是从白玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵液中提取得到的一个环酯肽类物质，化学式为C₇₂H₁₀₁N₁₇O₂₆，分子量为1620.67，其结构式如下：

 由于达托霉素独特的结构和作用机制, 与目前临床上使用的能够治疗多药耐药性革兰氏阳性敏感菌株所致危及生命的严重感染的药物相比，其具有如下特点：首先，它的作用机制与上市的各类抗菌药物都不相同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；同时，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的, 使耐药菌产生的几率大大降低。

离子交换层析介质是是生物大分子分离纯化中最常用的方法之一，广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质、抗生素以及天然产物的分离纯化。与传统的离子交换树脂相比，用于生物大分子分离的离子交换层析介质除了要具备高的离子密度、具有一定的耐压、耐酸碱性能外，还要求母体结构足够亲水，使其具有良好的生物相容性，并且要具有均匀的粒径。目前报道的达托霉素纯化方法很多，但是其中所用分离介质大多数不具备所有的以上特点，在实际应用中具有缺陷。

US6696412比较全面、详细地阐述了高纯度达托霉素的制备方法：顺序使用弱阴离子交换树脂FPDA-13、反相树脂HP-20SS、阴离子Poros P150或Poros D50纯化达托霉素，最后制得色谱纯度大于98％的达托霉素。但该专利所述方法操作极其复杂，产品损失很大，很难实现规模化制备。

CN200910058577.7公开了一种高纯度达托霉素的纯化方法，该方法采用缓冲溶液和达托霉素粗品混合液为上样液，以复合型YT-01反相硅胶填料为层析介质，以强极性的水溶液为洗脱液，得到色谱纯度大于98%的达托霉素。但是硅胶基质不能耐碱性，这限制了它的应用范围。

CN201010196247.7公开了一种达托霉素的纯化方法，将半纯化的达托霉素用葡聚糖凝胶DEAE Sephadex A-25或琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow纯化，得到达托霉素的纯度高于98%，但是该方法中使用的分离介质为多糖骨架，骨架较软，不可耐高压；而且，葡聚糖凝胶DEAE Sephadex A-25在不同盐浓度下床体积会发生非常明显的变化，这在工业应用上有很大的局限。

发明内容

本发明的目的是提供一种能达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量的层析介质。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：单分散聚甲基丙烯酸酯强阴离子交换层析介质在达托霉素柱层析纯化中的应用，采用单分散聚甲基丙烯酸酯强阴离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。

优选的，用所述单分散聚甲基丙烯酸酯强阴离子交换层析介质作为色谱柱的固定相，将含达托霉素的样品上样在该色谱柱上，用盐的水溶液作为流动相洗脱吸附在填料上的达托霉素。

优选的，所述盐的水溶液是NaCl的水溶液。

优选的，所述单分散聚甲基丙烯酸酯强阴离子交换层析介质是由苏州纳微生物科技有限公司生产，产品型号为NM-Q。

NM-Q是在亲水性的聚甲基丙烯酸基质表面键合上强阴离子交换基团，其填料床的体积不会随流动相浓度发生变化，在纯化达托霉素时，只需要低浓度的盐水溶液就可将吸附在填料上的达托霉素洗脱下来，达到高纯度及高回收率，同时，强耐反压性能使其能够在高流速下操作。

本发明的有益效果是：本发明应用单分散聚甲基丙烯酸酯强阴离子交换层析介质NM-Q作为柱层析的填料，不但利于以水溶液做流动相分离纯化达托霉素粗品，达到高纯度和高回收率，而且柱层析不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化，层析填料可耐高压和高流速、并具备高载量。

附图说明

图l是实施例l中使用的单分散聚甲基丙烯酸酯强阴离子交换层析介质NM-Q光学显微镜照片。

图2是实施例l中提纯前的达托霉素粗品的HPLC分析图谱。

图3是实施例l中提纯后的达托霉素的HPLC分析图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1 ，