[发明专利]一种质粒DNA定量检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明属于生化分析领域，具体涉及一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

质粒DNA是游离于染色体外的小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。它通常编码一些酶基因，如产生抗生素、抗生素抗性、限制酶、修饰酶等有利于宿主的酶基因。由于它分子小、能够自主复制并且稳定遗传，因此是分子生物学、基因工程技术中常用的载体。在分子生物学领域进行DNA分析时常常需要对质粒DNA进行准确定量，如进行克隆文库构建时的酶切和连接操作，以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果，都需要对质粒DNA的浓度进行准确测定。因此对质粒DNA定量有着广泛的应用。

采用PicoGreen荧光染料法对核酸进行定量，因其方法的灵敏度高、线性范围广，因此应用非常广。然而，PicoGreen荧光染料法在对DNA进行定量时的局限性表现为，第一，方法的准确度高低取决于试剂盒中DNA标准品含量的准确度，而目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，即？ng/ml，这个值一般是通过紫外吸收（OD260）确定的，该值也没有相关的不确定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准（48.5K）。有报道称：以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的商业化的试剂盒还无法满足要求。

因为PicoGreen荧光染料法对质粒DNA定量需要具有准确量值的质粒DNA标准物质，而目前并没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此要研制质粒DNA标准品，必须选择准确度高，溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。对质粒DNA进行绝对定量的方法有基于单分子扩增的数字PCR方法、有依赖于磷元素标准的电感耦合等立体发射光谱法。我们建立了一种基于核苷酸标准品的超声波-同位素质谱法，可对质粒DNA进行绝对定量，从而为PicoGreen荧光染料法提供DNA标准。

发明内容：

本发明的目的是提供一种质粒DNA荧光染料定量检测方法和检测试剂盒，该方法灵敏度高，线性范围广，准确度高，精密度好。

本发明首次建立了质粒DNA荧光染料法定量检测方法，采用质粒DNA标准，利用PicoGreen法对质粒DNA进行准确定量，本发明人进行了如下研究工作：

1、质粒DNA浓度与荧光信号强度是否存在线性关系（见实施例1）

将构建的5k大小的质粒稀释成不同浓度的DNA样品，稀释后的质粒DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号。

结果发现：质粒DNA浓度与荧光信号成正比，线性相关系数为0.99。因此可以以荧光信号强度测算质粒DNA浓度。

本研究为确定本方法的可行性打下了基础。

2、不同分子量大小的DNA与荧光信号强度的线性关系差别（见实施例3）

选择了分子大小分别为5k，9k，48k的质粒/基因组分子作为研究对象，分别将DNA进行梯度稀释，稀释后的DNA与PicoGreen荧光染料结合后，测定荧光信号。

结果发现：4种不同分子量的DNA，浓度与荧光信号均成正比，且线性相关性都很好，相关系数均>0.99。但不同分子量大小的DNA与荧光信号的线性关系（斜率）不同，分子量越大，直线的斜率越大。

以商业化试剂盒lambda DNA作为标准（48k）测定2k～10k的质粒DNA，结果偏差较大，具体见表2。

此研究结果表明，测定质粒DNA浓度应选择分子量差别不大的质粒DNA标准品。

3、研究了对质粒DNA定量的线性范围（见实施例2）

将质粒DNA稀释至0.01ng/mL~10000ng/mL，与荧光染料结合后，测定荧光信号值，结果发现DNA浓度在0.25ng/mL~1000ng/mL之间时，荧光强度与DNA浓度成正比。

此研究确定了荧光染料法定量检测DNA的浓度范围是0.25ng/mL~1000ng/mL。

3、研究了对质粒DNA的检测灵敏度（见实施例2）