[发明专利]一种质粒DNA定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种质粒DNA定量检测试剂盒，试剂盒中具有标准品、工作液和染料，其特征为：

1）所述标准品为具有准确DNA浓度定量值的环状质粒分子DNA，浓度范围是1ng/μL～300ng/μL；

2）所述工作液成分为10mM Tris-HCl，含1mM EDTA，pH=8.0；

3）所述染料是PicoGreen荧光染料。

2.权利要求1所述的试剂盒，所述标准品浓度的定量方法为：将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱法分离单核苷酸并准确定量；其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解。

3.权利要求2所述的试剂盒，所述前处理条件为：

1）超声波处理：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：25min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4°C；

2）所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为0.02-0.025U/μL；

3）磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为100min以上。

4.一种质粒DNA荧光染料法定量检测方法，其特征为：

用不同浓度的质粒DNA标准品与PicoGreen荧光染料混合，分别测定荧光信号强度，绘制浓度—荧光信号强度标准曲线；然后将待测质粒DNA样品稀释至0.25ng/mL~1000ng/mL，与荧光染料混合后，测定荧光信号强度；根据所绘制的标准曲线计算待测质粒DNA样品的DNA浓度。

5.权利要求4所述的方法，具体操作步骤如下：

1）配制合适浓度的荧光染料

用工作液稀释PicoGreen荧光染料至0.6~1.0μM浓度；

2）制备不同浓度的标准品检测液

用工作液对标准品进行梯度稀释，得到4～8个浓度的稀释液；取每一种浓度的标准品稀释液100μL分别与100μL步骤1）得到的荧光染料混匀；

3）制备待测物检测稀释液

A将待测质粒DNA样品用紫外法测定大致浓度范围后，用工作液稀释至浓度为0.25ng/mL～1000ng/mL；

B取稀释好的样品100μL与100μL步骤1）得到的荧光染料混匀；

4）测定不同浓度标准品的荧光信号，绘制浓度—荧光信号强度曲线

A将上述不同浓度的标准品检测稀释液转移至同一个96孔酶标板上，用酶标仪分别读取每种浓度标准品的荧光信号强度；

B以标准品每种DNA浓度为横坐标，以相应的荧光信号值为纵坐标绘制“荧光信号值—DNA浓度”标准曲线；

5）测定待测物荧光信号

方法同步骤4）A；

6）计算待测样品浓度

将待测样品荧光信号值代入步骤4）B得到的标准曲线，得出待测样品的浓度；

所述工作液的成分是10mM Tris-HCl，含1mM EDTA，pH=8.0。

6.权利要求5所述的方法，测定荧光信号时，设置酶标仪激发波长480nm，吸收波长为520nm。