[发明专利]一种固定化酶及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于材料改性及生物化工领域，涉及一种固定化酶及制备方法。

背景技术

固定化酶指经物理或化学方法处理后，使酶变成不易随水流失，即运动受限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。与游离酶相比，固定化酶的优点有：可多次使用，且酶的稳定性高；反应后，固定化酶易与底物和产物分离；反应条件易于控制，有利于自动化生产。

壳聚糖是一种自然界中的天然多糖,其资源量仅次于自然界中含量最为丰富的纤维素。其化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖，它是甲壳素的重要衍生物。而甲壳素主要来源于节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及真菌等生物体，每年在地球上的自然生成量达十亿吨之多。由于壳聚糖的生物亲和性高、可用于化学修饰的基团多、亲水性强、易交联成形、无毒对环境友好等特点，它作为固定化酶载体的研究很早就引起了很多学者的重视。但是至今为止，由于合成的壳聚糖固定化酶的机械强度低，易磨损等特点，限制了其在实际生产中的应用。

聚乙烯醇是一种水溶性高分子材料，这种材料廉价易得。而且动物实验表明，其完全无害，无毒性，无刺激性并且有良好的生物相容性，能够在体内缓慢降解，广泛应用于制备止血纤维、人工皮肤，还可以用于代血浆、眼药膜等，也可以作为药物缓释载体材料制备靶向微球或者用来制备固定化酶载体。将酶包埋于聚乙烯醇小球中，制成固定化酶是现在常用的一种固定化酶方法。

聚乙烯醇与壳聚糖相比，有着机械强度高，耐磨性强的特点，但是壳聚糖又有着可修饰基团多的优点。所以，将这两种材料复合，形成一种兼有两者优点的复合材料，并将其用于固定化酶，受到了很多研究人员的关注。但是，迄今为止，文献报道的复合材料都是简单的物理作用力连接的，材料的机械强度、物理化学稳定性差。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种酶载量高，稳定性好的固定化酶。

本发明的第二个目的是提供一种固定化酶的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种固定化酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)按比例将10g平均聚合度为1750±50的聚乙烯醇加入100-150mL水中，搅拌下加热至75-85℃，保温1.5-2.5h，加入1-5mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，再滴加1-2mL、浓度为1mol/L盐酸水溶液，搅拌0.5-2.5h，得到改性聚乙烯醇的溶液；

(2)按比例将50mL所述改性聚乙烯醇溶液与50-250mL壳聚糖溶液混合，搅拌1-2h，抽真空除去溶液中的气泡，得到均相的混合液，将30mL所述均相混合液滴于100-150mL氢氧化钠溶液中，固化1-3h，用蒸馏水洗至中性，过滤，得到复合小球载体；

所述壳聚糖溶液是用下述方法制成：将1-4g脱乙酰度≥85%的壳聚糖加入100mL水中，在搅拌下加入1-3mL冰醋酸，继续搅拌2-3h，得到壳聚糖溶液；

所述氢氧化钠溶液是用下述方法制成：将6-12g氢氧化钠溶解于100mL水中，再加入20mL乙醇混合均匀；

(3)按比例将4g所述复合小球载体置于20-50mL、质量浓度为1%-5%的戊二醛-缓冲液溶液中，震荡活化1-5h，用缓冲液洗3-5次，除去未反应的戊二醛，得到活化后的载体小球；

(4)按比例将4g所述活化后的载体小球置于10-50mL、浓度为0.25-1.25mg/mL的酶-缓冲液溶液中，震荡10-20h，用缓冲液洗3-5次，除去未交联的酶，得到的固定化酶小球真空冻干；

所述缓冲液为pH=7.0的磷酸盐缓冲液。

步骤（1）优选为：按比例将10g平均聚合度为1750±50的聚乙烯醇加入125mL水中，搅拌下加热至80℃，保温2h，加入3mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，再滴加1.5mL、浓度为1mol/L盐酸水溶液，搅拌1.5h，得到改性聚乙烯醇的溶液。

步骤（2）优选为：按比例将50mL所述改性聚乙烯醇溶液与150mL壳聚糖溶液混合，搅拌1.5h，抽真空除去溶液中的气泡，得到均相的混合液，将30mL所述均相混合液滴于125mL氢氧化钠溶液中，固化2h，用蒸馏水洗至中性，过滤，得到复合小球载体；

所述壳聚糖溶液是用下述方法制成：将3g脱乙酰度≥85%的壳聚糖加入100mL水，在搅拌下加入2mL冰醋酸，继续搅拌2.5h，得到壳聚糖溶液；

所述氢氧化钠溶液是用下述方法制成：将9g氢氧化钠溶解于100mL水中，再加入20mL乙醇，混合均匀。