[发明专利]一种白喉类毒素疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种白喉类毒素疫苗的制备方法。

背景技术

白喉类毒素疫苗由白喉杆菌菌种制成，白喉杆菌菌体分泌出来的毒素是单一的多肽链，不含糖基和辅基，蛋白质由560个氨基酸组成，分子量为62kDa，是一种酶原，只有在蛋白酶的作用下，将其切成缺口毒素，才具有生物活性。等电点约为pH4.1，在pH6时，加热至55℃就很快失去活性而凝固。白喉类毒素包括A、B两个片段，其中B片段是受体结合和穿膜片段，A片段是毒性片段，通过阻抑蛋白合成中的酶活性，最终引起细胞死亡。它对远端组织和器官也可产生毒性，尤其是心脏及外周和中枢神经系统。

现有的制备方法所得到的白喉类毒素疫苗选择性差，质量不高，纯度低（400-600Lf/mg TN），色泽深，用聚丙烯酰胺电泳检查，仍然是一个多种成分的混合体。特别是菌液分离、白喉毒素溶液的浓缩、白喉毒素的提纯、脱盐这些过程较为简单粗放，有些工艺不符合GMP要求而被淘汰，有些工艺方法在大生产条件下使用会受到限制。例如菌液分离工艺中，一般大生产要处理的体积要达到500L以上，若采用离心则不太适合，处理的时间会很长，耗费大量的劳动力；若采用帆布过滤除菌，存在过滤不彻底和帆布材料不符合GMP要求的缺陷；板框过滤的缺点是滤板易堵塞，过滤时间可能过长；切向流过滤不易堵塞，过滤速度也较理想，但对菌体、蛋白的剪切力较大。白喉类毒素溶液的浓缩可采用沉淀剂沉淀后用绸布过滤得到沉淀，然后重悬沉淀，但是绸布用到生产中不符合GMP要求；采用切向流过滤，同样也存在对蛋白的剪切力较大和过滤速度较慢的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种白喉类毒素疫苗的制备方法，以提高白喉类毒素疫苗的生产效率和产品质量。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种白喉类毒素疫苗的制备方法：将白喉杆菌菌种经传代发酵，甲醛脱毒后，将培养液调节pH至6.9~7.5，然后用孔径为0.22~0.45μm的中空纤维滤膜过滤除去菌体，滤液用孔径为10~40KD中空纤维滤膜进行超滤，直至滤液的体积为原体积的1/8~1/10，然后向滤液中加入质量体积比为25%~27%的硫酸铵，第一次盐析后过滤，向滤液中再次加入质量体积比为15%~19%的硫酸铵，第二次盐析后离心分离，将离心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔径为10~40KD的中空纤维滤膜进行超滤，直至滤液中硫酸铵含量小于0.025%。

优选的，超滤中所用的空纤维滤膜的孔径为30KD。

所述超滤的进口压力为1.5~2.5bar，回流口压力为0.2~1bar，流速为200~240L/小时。

优选的，所述超滤的流速为220L/小时。

本发明先将培养液用孔径为0.22~0.45μm的中空纤维滤膜除去菌体，再进行精制，从而减少后续过滤工艺中菌体和其他杂质碎片堆积引起的孔道堵塞；通过改进盐析方法，有效去除了培养液中的毒素蛋白和其他致敏原；培养液的浓缩和盐析后的脱盐方法采用的均是切向流超滤方法，减少了因对毒素蛋白的剪切造成的抗原破坏，避免了蛋白的沉淀，缩短了制备时间，提高了生产效率。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图；

图2是本发明中空纤维滤膜超滤的工作原理图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

白喉类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）白喉类毒素的培养

采用白喉杆菌PW8株（CMCC 38007），在马丁培养基中培养5代后，转入大罐中以深层搅拌，在34~36℃条件下表面通气法培养48~50小时，培养结束后按培养量的0.6%（V/V）加入甲醛溶液，30~35℃杀菌30分钟，用管道输送至精制罐中。

2）菌液分离

取白喉类毒素培养液30L（324Lf/ml），用NaHCO₃调节溶液pH值至6.9，采用中空纤维超滤系统中的微滤模块（该系统型号为MUF-HF7美国PALL，其中包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3Bar以上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径为0.22μm），对发酵液进行切向流超滤，去除菌体，所述的切向流超滤步骤为：

开启泵前，检查管道流路，打开微滤柱管道滤出端和回流端的阀门，关闭超滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；

打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5~3.5bar,回流口压力达到0.2~1bar，开始微滤，收集滤出端液体；