[发明专利]一种质粒型腺病毒载体pAd-IGF2及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种质粒型腺病毒载体pAd-IGF2及其构建方法和应用，该质粒型腺病毒载体腺病毒载体的构建以及在改造种子细胞和牛IGF2功能鉴定的应用。

背景技术

AdEasyTM系统是由T.C.He等(1998)构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1)、腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2)、基因组过大(36kb)，难于操作。

在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这两点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PacI线性化，暴露其反向末端重复序列(ITR，Iaverted Termined Repeats)，转染293A细胞后产生重组病毒颗粒。

同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此该同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。

与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1～3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。

一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。

Laere等(2003)研究发现，IGF2基因内含子3的3072位点的一单碱基突变(G→A)正好位于高度保守的调控区域，影响猪骨胳中IGF2的表达，并且对出生后的肌肉形成起重要作用；这一突变的单核苷酸与瘦肉率存在相关性，可增加3％~4％的瘦肉量。这一变异位点的发现引起众多学者的重视(Jungedus et al.2004；Braunschweig et al.2004；Estelle et al.2005)。鼠的纤维原细胞体外实验结果表明，在IGFs信号通路中，1GF2的高表达可以刺激下游蛋白激酶B(Akt)丝氨酸(Ser)和IGF-1R跨膜苏氨酸(Tyr)的磷酸化，从而促进成肌因子(MyoD)家族的基因表达，使单核成肌细胞融合成多核肌管，最终形成肌肉；而当IGF2水平较低或抑制时，则阻碍肌肉生成(Wilson et al.2003)。

IGFs系统由一组配体、受体和结合蛋白组成。配体包括胰岛素、IGF-1和2，IGF-1和2可促进细胞的有丝分裂和分化，抑制细胞凋亡，刺激DNA合成和细胞复制，诱导G0期静止状态的细胞进入G1期，推动细胞依次经历细胞周期的各个时期(Laviola et al.2007)。相应受体为胰岛素受体、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)和胰岛素样生长因子2受体(IGF-2R)，其中，IGF-1R可分别与IGF-1和IGF-2结合，但与IGF1的亲和力大于IGF-2，而IGF-2R则与IGF-2的亲和力高于IGF-1。结合蛋白共6种，即胰岛素样生长因子结合蛋白1~6(IGFBP1~6)，其可为位于细胞外和细胞外周间隙的IGFs提供特异结合位点并调节IGFs和相应受体之间的相互作用。