[发明专利]超灵敏黄曲霉毒素B1酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测试剂领域，更具体地说，涉及一种检测黄曲霉毒素B₁的酶联免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一种极强的剧毒物质，已被世界卫生组织的癌症研究机构划定为1类致癌物。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食、饲料及其制品中。黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁及G₂是粮食和食品中黄曲霉毒素主要存在形式，其中黄曲霉毒素B₁的毒性和致癌性最强。由于自然界黄曲霉产毒菌株产生的毒素以AFB₁的为主，而且其毒性和致癌性最大，因此，在检验中通常都以AFB₁作为分析指标。

黄曲霉毒素B₁的分子式为C₁₇H₁₂O₆，化学结构如下：

其结构中含有一个双呋喃环和一个香豆素，前者为基本毒性结构，后者与其致癌性有关。黄曲霉毒素B1对雏鸭的半致死量仅为0.3mg/kg体重，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。当食品、饲料及其相关制品保存不当极易受到黄曲霉毒素B1的污染，黄曲霉毒素B1进入人体后，其主要靶器官为肝脏，急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。目前，我国规定各种食物或饲料中黄曲霉毒素B₁的最高允许量根据来源不同为0.5～20.0μg/Kg。国际上AFT最大允许含量不断降低，2004年欧盟再次修订对婴儿和儿童食品中AFT的限量标准，包括谷类食品在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿食品，AFB1的最大允许限量均为0.10ug/kg。因此，建立简便，快捷，超灵敏，低浓度预警的黄曲霉毒素B1检测方法显得尤为重要。

目前，国内检测黄曲霉毒素常用的仪器方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、微柱层析法。薄层色谱法是最早应用于黄曲霉毒素检测的方法，在黄曲霉毒素鉴定分离方面具有重要地位。其原理是利用样品中的黄曲霉毒素与其它物质在固定相硅胶和流动相中的分配系数不同，达到分离的目的，再用365nm波长的紫外线激发黄曲霉素产生荧光，根据荧光的强弱与标准品比较测定含量。但此方法灵敏度低、特异性不强，样品处理繁琐，分析时间长，进行目测定量分析时主观性影响较大。黄曲霉毒素的高效液相色谱法包括正相液相色谱法(NP-HPLC)和反相液相色谱法(RP-HPLC)，检测器可用紫外检测器和荧光检测器，由于HPLC-荧光检测器灵敏度比紫外检测器高30-40倍，所以目前多使用HPLC-荧光检测器。但此法测定中最大问题是主要黄曲霉毒素的荧光发射依赖于溶剂的组成，黄曲霉毒素B1的荧光强度较强但在含水的溶剂中容易发生淬灭。微柱层析法主要利用硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素后，在365nm波长紫外灯下呈蓝紫色荧光带，再与系列定量标准溶液的微柱管比较进行半定量，灵敏度为5-10ug/kg，回收率在90％以上，但需其他分析方法进一步测定确认。这些方法测定的准确度较高，重复性较好，但往往需配备大型较昂贵的设备，费用高，对操作人员要求高，一般适于在国家或地区级研究所或科研单位大型实验室中应用。

随着生物技术的不断发展，免疫分析法的应用开辟了黄曲霉毒素B1检测的新领域。目前常用的方法有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶联免疫分析法等。其中，放射性免疫分析虽高灵敏、高特异性，但存在有效期短、具有放射性污染的问题；荧光免疫分析法虽然特异性强、敏感性高、速度快，但非特异性染色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，程序也比较复杂。而酶联免疫法集合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法灵敏度高，比薄层法提高了近200倍；特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰；而且回收率高，提取方法简单，可进行定性定量测定。但目前黄曲霉毒素B₁的酶联免疫分析方法的检测限通常只能达到0.1ng/mL，而对于更低浓度的黄曲霉毒素B₁则不能进行准确定量。由于黄曲霉毒素B₁的慢性毒性强，若能在产黄曲霉毒素细菌生长的初期就将其鉴别出来，对于社会、经济效益均有重要意义，因此，我们研发了比传统酶联免疫试剂盒灵敏度更高的超灵敏黄曲霉毒素B₁检测试剂盒。

发明内容