[发明专利]产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

2,3-丁二醇(2,3-Butanediol)是一种重要的化工原料，广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域，具有良好的应用前景；同时，通过特定的化学反应，2,3-丁二醇可以衍生出多种重要的化学品如3-羟基丁酮、甲乙酮及1,3-丁二烯。因此，它被视作一种极具潜力的平台化合物。

2,3-丁二醇分子内含有两个手性碳原子，因此存在三种立体异构体。 其中(R, R)-2,3-丁二醇不仅具有混旋型2,3-丁二醇的一般功能，而且还可以用于制备手性化学品以及作为高级防冻剂。

目前，(R, R)-2,3-丁二醇的生产主要采用化学合成法，先由1-丁醇脱水得1-丁烯，再经加成得2-氯-丁烷，再消除得2-丁烯，再与次溴酸反应生成3-溴-2-丁醇，然后在碱液中水解可得到2,3-丁二醇的外消旋混合物，最后通过外消旋体的拆分得到(R, R)2,3-丁二醇（纪晓俊, 聂志奎, 黎志勇,  高振,  黄和. 化学进展, 2010, 22: 2450-2461）；但是化学合成法过程繁琐，最后还需要通过化学法进行手性拆分，因此成本高、难以实现大规模生产。 

在制备化学品的方法中，微生物制造方法与化学合成法相比，其原料丰富、工艺简单、环境友好，因此越来越受到各国科学家的青睐。据报道，传统的天然微生物一般都生成两种不同构型2,3-丁二醇的混合物，至今还没有发现单一生成某种构型2,3-丁二醇的微生物(Celińska E, Grajek, W. Biotechnol Adv, 2009, 27: 715–725)。利用传统的天然微生物发酵法难以实现单一构型的2,3-丁二醇的高纯积累，而且由于不同立体构型2,3-丁二醇的物理化学性质十分相近，实现其分离很困难，故通过构建能够产单一构型2,3-丁二醇的基因工程菌则有望解决该问题。 

据报道，目前构建出的基因工程菌都只能在IPTG存在的情况下表现出较强的外源蛋白表达和目标产物积累的能力，且产(R, R)-2,3-丁二醇的能力均偏低。诱导剂对细胞的生长有一定的抑制作用，且价格相对昂贵，若利用基因工程菌进行工业化生产，诱导剂的添加必会大幅增加成本，不利于(R, R)-2,3-丁二醇的规模化生产。

发明内容   

本发明的目的是提供产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌，该基因工程菌能在不添加任何诱导剂的情况下发酵产高纯度的(R, R)-2,3-丁二醇。

本发明的另一目的是提供上述基因工程菌的构建方法，该方法简单，效率高。

本发明的再一目的是提供上述基因工程菌在制备(R, R)-2,3-丁二醇方面的应用，该制备方法简单，产率高，对环境友好，成本低廉。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌，是将budB基因、budA基因和ydjL基因通过表达载体导入宿主菌得到的重组菌。

所述宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655。

所述表达载体为pTrc99a。

一种构建所述产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步骤：

（1）从肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011中分别扩增budB基因和budA基因，从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168中扩增ydjL基因；

（2）利用重叠延伸PCR技术将budB基因、budA基因和ydjL基因拼接得到budB基因、budA基因和ydjL基因的融合基因；

（3）将所述融合基因插入表达载体的多克隆位点处，得到重组质粒；

（4）将所述重组质粒导入宿主内即得所述产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌。

步骤（1）中用于扩增budB基因的引物为P1和P2；用于扩增budA基因的引物为P5和 P6；用于扩增ydjL基因的引物为P9和P10；