[发明专利]抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，针对白唇竹叶青蛇伤的治疗药物，本发明提供了一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法。

背景技术

毒蛇咬伤突发性强、病情重、进展快及死亡率高，尽快、尽早应用抗蛇毒血清是治疗蛇伤最有效的方法。蛇毒血清系用脱毒的蛇毒免疫马匹，血浆经胃酶消化、硫酸铵盐析后，再进一步精制提纯，制成以去除Fc片段的IgG为主要成分的抗毒血清制剂。抗蛇毒马血清具有分子量大、价格昂贵、流通不便、分离制备复杂，特别是该制剂中的马源IgG系异种蛋白，故常发生过敏反应，一般多见的有皮疹、喉头水肿、血压下降、四肢关节疼痛、血清病、过敏性休克等III型变态反应。

1962年，Williams等发现母鸡受抗原免疫之后，其血液中产生的特异性抗体可转移至卵黄中，因此将卵黄中的免疫球蛋白称为卵黄抗体(egg yolk immunoglobulin，IgY)。自20世纪90年代以来，已有学者从鸡卵黄中制备出了抗巴西响尾蛇毒、抗具窍腹蛇毒、抗蝰蛇毒、抗蝮蛇毒、抗眼镜王蛇毒及抗中华眼镜蛇毒等数种IgY。与现有的马源性蛇毒抗体相比，抗蛇毒IgY具有以下优点：①产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的蛇毒蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类有较强的免疫原性；②收集鸡蛋无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则；③IgY产量高，约100mg/蛋；卵黄中没有其他的Ig，易于提纯；④由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4℃条件下6个月，IgY活性损失很小，有利于大规模的提纯IgY；⑤IgY具有较强耐热、耐酸、抗离子强度和抗酶降解能力；⑥IgY不会激活哺乳动物补体系统及细胞表面Fc受体，故可显著降低过敏反应率；⑦IgY不与哺乳动物的RF因子，类风湿因子、SPA、SPG结合，故作为免疫诊断的工具，用于测定患者体内蛇毒种类及残留量，可大大减少假阳性。因此，IgY已成为新一代蛇伤特效药物研制的一个重要方向。

白唇竹叶青(Trimeresurus albolabris)隶属蝰科蝮亚科(Crotalinae)竹叶青属(Trimeresurus)，是我国十大毒蛇之一，其毒液主要含有凝血毒素、出血毒素及各种酶类等，如类凝血酶、磷脂酶、5’-核苷酸酶等组分，蛇伤后表现为血液毒中毒引起的局部出血、肿胀、疼痛，严重者伤口流血不止，血液不能凝固，全身出血，凝血酶原时间及活化部分凝血酶时间延长，纤维蛋白原减少等弥散性血管内凝血(Disseminated ordiffuse intravascular coagulation，DIC)。目前尚无特异针对白唇竹叶青蛇伤的治疗药物，因此本发明提供了一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种能够特异针对白唇竹叶青蛇伤的治疗药物的制备方法。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现：

本发明一方面涉及一种抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体的制备方法，其包括如下步骤：

(1)取成年白唇竹叶青蛇的蛇毒制备白唇竹叶青蛇毒抗原，将抗原注射到产蛋母鸡中，免疫后收集鸡蛋低温保存；

(2)提取和纯化抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体：

①水稀释法

取免疫后鸡蛋，分离出蛋黄液，用双蒸水将卵黄液按1∶8-10稀释，调节pH值为5.0-5.2之间，搅拌均匀，0-4℃放置10h-12h，然后以16000-20000g/min低温超速离心10-20min，上清液经超滤浓缩，即为卵黄抗体水提物；

②硫酸铵盐析法

在卵黄抗体水提物中加入硫酸铵至35-45％饱和度，充分混匀，0-4℃放置6-10h，离心后弃上清，沉淀即为IgY盐析物；

③嗜硫色谱法

先以pH 7.4-7.6的含0.5-0.7M Na₂SO₄的15-25mM PBS平衡HiTrap IgY Purification HP色谱柱，将IgY盐析物用上述缓冲液溶解后过0.45μm滤膜，通过自动进样阀上样，洗脱未结合组分后，换用pH 7.4-7.615-25mM PBS(不含Na₂SO₄)进行洗脱，流速1ml/min，检测波长280nm，收集洗脱峰，经脱盐处理后冻干，即得本发明的抗白唇竹叶青蛇毒卵黄抗体。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的取成年白唇竹叶青蛇的蛇毒是通过咬皿法取毒，冷冻干燥后低温保存。