[发明专利]发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，特别是涉及一种发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。

背景技术

2-酮基-D-葡萄糖酸是一种葡萄糖氧化产物，是一种目前大规模生产的有机酸，其可以用作食品添加剂、水泥增塑剂、洗涤剂等。目前2-酮基-D-葡萄糖酸主要用于合成D-异抗坏血酸。D-异抗坏血酸与L-抗坏血酸（维生素C）性质接近，具有抗氧化作用和抗坏血酸作用，广泛用于食品添加剂，替代L-抗坏血酸。

2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有3类，包括：酶法合成、化学合成和发酵法生产。发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸主要利用假单胞菌属的细菌、粘质沙雷氏菌、产酮产碱菌等细菌为生产菌株，利用葡萄糖为原料发酵生产。其中，工业上主要选用荧光假单胞菌为生产菌株（魏转,余泗莲,孙文敬,周强,李中兵.2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产研究进展，食品科学，2008,08：636-639）。

肠杆菌科的很多种细菌可以氧化葡萄糖生产葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸，其中包括克雷伯氏菌属的一些菌株，有报道克雷伯氏肺炎杆菌NCTC418在部分营养成分限制条件下培养可以合成葡萄糖和2-酮基-D-葡萄糖酸（Ed T.Buurman,Josc L.Boiardi,M.Joost Teixeira de Mattos,Oense M.Neijssel，The role of magnesium and calcium ions in the glucose dehydrogenase activity of Klebsiella pneumoniae NCTC418，Arch Microbiol(1990)153：502-505）。

利用假单胞菌属的细菌、粘质沙雷氏菌和产酮产碱菌等细菌发酵培养温度一般在28℃，使得生产中用于降温的能耗较高；同时，假单胞菌属的细菌容易感染噬菌体，影响生产。因此，需要开发更为经济性的生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种发酵法生产2-酮基D-葡萄糖酸的方法。通过该方法，能够经济高效地生产2-酮基-D-葡萄糖酸。

为解决上述技术问题，本发明的发酵法生产2-酮基D-葡萄糖酸的方法，是利用2,3丁二醇合成途径缺失的雷伯氏肺炎杆菌作为生产菌株，在好氧发酵条件下，控制发酵液处于酸性条件，以葡萄糖为原料生产2-酮基-D-葡萄糖酸。

所述2,3-丁二醇合成途径缺失的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，是通过对克雷伯氏肺炎杆菌2,3-丁二醇合成途径中乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，实现克雷伯氏肺炎杆菌合成2,3-丁二醇能力的消除。

其中，乙酰乳酸合成酶基因或乙酰乳酸脱羧酶基因或双乙酰氧化还原酶基因进行失活，是通过基因突变进行失活，优选为通过基因同源重组进行失活。

所述控制发酵液处于酸性条件中，可通过加入碱液或碳酸盐进行调节，使其保持一定的酸性；其中，碱液包括：氢氧化钠、氢氧化钾和氨水，碳酸盐包括：碳酸钙、碳酸钠和碳酸氢钠。

所述酸性条件中，其pH值为6.5～3，优选pH值为5.5～4.5。

所述好氧发酵条件中，发酵温度为20～45摄氏度，优选35～40摄氏度。

本发明的发酵法生产2-酮基-D-葡萄糖酸，具有较高的转化率，发酵过程控制容易，发酵过程降温能耗较低。

具体实施方式

以下实施例中涉及的构建的2,3-丁二醇合成途径消除的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366-budA^-，其具体的构建方法如下：

1、利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因（budA）。

根据克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578（Genbank:CP000647）基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶PCR引物，上游引物budA-s：GAAGATCAGAACATCGCCAGA（SEQ ID NO.1所示），下游引物budA-a：CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT（SEQ ID NO.2所示）。