[发明专利]一种大量制备2-O位脱硫酸基酶、3-O位硫酸基转移酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大量制备2-O位脱硫酸化酶、3-O位硫酸基转移酶的方法。属生物医药领域。 

背景技术

肝素应用于临床的历史已有近百年，主要用于抗凝血和抗血栓。然而肝素在临床上尚存有较大的副作用，有时甚至可能导致致死性颅内出血。这使得它的应用受到很大的限制。尽管这样，临床上仍然广泛用于治疗血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、体外循环、血液透析。人们试图通过血液监测、减小剂量、局部用药或使用新的剂型等以降低出血的危险性，从而最大限度的发挥肝素的治疗作用。但目前都无法从根本上解决这个问题。 

然而硫酸乙酰肝素在很大程度上克服了肝素应用的副作用，同时具有类似肝素的抗炎、抗血栓和降血脂等生物作用。硫酸乙酰肝素又叫葡萄糖胺聚糖链，是一类具有电负性的大分子线性聚合物。它广泛存在于哺乳动物以及一些植物体内。该聚合物在机体内不能游离存在，而是通过共价键结合在核心蛋白的丝氨酸与甘氨酸残基上共同组成硫酸乙酰蛋白聚糖。在肝素的基础上进行脱硫酸化与硫酸化得到硫酸乙酰肝素成为现在研究的一个热门研究。 

肝素的脱硫酸化修饰主要是在肝素结构的2-O-硫酸基、3-O-硫酸基、N-硫酸基、6-O-硫酸基位点。用硅烷化试剂制得6-O-硫酸基完全脱去的肝素，并没有发现其它副反应和解聚现象(Kariya Y，Kyogashima M，Suzuki K，et al.J Biol Chem，2000，275：25949-25958)。现研究发现不同位点的脱硫酸化肝素能不用程度抑制血小板与血纤蛋白和血浆蛋白的粘附，其作用强弱为6-O-脱硫酸基＞N-脱硫酸基＞2-O-脱硫酸基＞3-O-脱硫酸基产物，由此可见脱硫酸化肝素也可开发为抗血栓药物(Baumann H.Semin Thromb Hemost，2001，27：445-463.)。并有研究发现6-O和N-脱硫酸化肝素可降低肝素的抗病毒活性，而2-O和3-O位脱硫酸化肝素则基本无影响(Herold B C，Gerber S I，Polonsky T，et al.Virology，1995，206：1108-1116)。现研究也表明硫酸乙酰肝素的抗凝血活性主要通过含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心结合抗凝血酶(AT-III)，诱导其发生构象改变，从而显示抗凝血活性。其中3-O-位硫酸化由3-OST完成。这些硫酸基转移酶大多具有多种异构型式，其中，3-OST-1和3-OST-5能合成肝素戊糖活性中心。现有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-OST-1和3-OST-5很好的底物(J.Chen，M.B.Duncan，K.Carrick et.，Glycobiology，2003，13：785-794)。 

发明内容

本发明的目的是提供一种大量制备2-O位脱硫酸化酶、3-O位硫酸基转移酶的方法 

具体技术方案为：利用实验室保藏的分别携带2-O位脱硫酸化酶基因、3-O位硫酸基转移酶基因的两种质粒，通过转化得到大肠杆菌重组工程菌；将工程菌按1％接种在带有抗生素卡那霉素的LB培养基中进行菌种活化，活化后接种到装有100ml培养基的摇瓶中培养一段时间，对重组菌进行诱导产酶优化，分别优化诱导前菌体浓度、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导温度、诱导时间等条件，得到大量含有2-O位脱硫酸化酶与3-O位硫酸基转移酶的菌体溶液；将菌液倒入离心杯4℃离心，倒掉离心杯中的上清液，用bufferA将离心杯中菌体洗脱下来，在冰浴下超生破碎，离心破碎后的菌液，取上清粗酶液，将粗酶液通过镍柱(Ni-NTA Agarose Fast Flow)，上样完后静止30min让酶充分与镍柱螯合，再用BufferA洗脱杂蛋白，然后用bufferB将螯合的酶洗脱下来，得到了纯度高达90％的纯酶；在摇瓶优化的基础上，将工程菌活化，接种到高密度发酵培养基中进行高密度发酵，控制好温度、pH值、溶氧量、流加速度、诱导前菌体浓度OD600值等条件，采用提高单位体积菌体浓度的方法进一步提高了两种酶的产量。本发明能够降低两种酶的生产成本，为其工业化生产提供了新的途径。 

所述方法中，加入的抗生素卡那霉素为20mg/mL-100mg/ml，优选50mg/ml。 

所述方法中，两种重组菌的诱导前，在600纳米下测定的吸光度值(OD600)为0.6-3.0，优选0.6-0.8。 

所述方法中，两种重组菌的诱导剂IPTG的浓度为0.6mM-2.0mM。优选IPTG的浓度为1.2mM。 

所述方法中，两种重组菌的诱导温度为16℃-30℃，优选诱导温度为20℃。