[发明专利]基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白GHb试剂盒及其检测方法。 

背景技术

糖尿病是人类健康的世界性公共卫生问题，糖尿病是一种终生性疾病，其并发症是至残至死的主要原因，所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白( GHb)作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标。GHb是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆地进行非酶促蛋白糖化反应的产物。形成两周后不易分开。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的GHb含量也会相对较高. 正常生理条件下，非酶促糖化反应产物的生成量与反应物的浓度成正比。由于蛋白质浓度保持相对稳定，糖化水平主要决定于葡萄糖浓度，也与蛋白质与葡萄糖接触的时间长短有关。GHb可以反映最近2—3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检测GHb，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标。普及糖尿病知识，更新治疗理念，监测并保持GHb达标，更早、更合理地使用胰岛素等药物治疗，对于控制糖尿病并发症的发生发展尤为重要。 

目前常用的糖化血红蛋白GHb的检测方法有以下几种类型： 

高压液相方法(HPLC)：可全自动分离测定GHb及血蛋白的变异体和亚型，但仪器的操作保养要求较高，CV值1%以内，难以在比较基层的医院和实验室普及；微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE等)对结果干扰，扰程度根据柱的分离能力而定，且要仔细观察图谱，所以该法得不到普遍采用。

免疫方法：免疫方法是目前采用比较多的检测手段，主要包括以下几种检测方式。 

（1）比浊法：利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的B链N末端提供了一个容易被抗体识别的抗原表位，用单克隆抗体特异识别GHb的B链N末端最后4～6个氨基酸组成的抗原表位，结合比浊法测定。 

（2）离子捕获法：应用抗原抗体反应原理，并联以荧光标志物，通过连接带负电的多阴离子复合物，吸附到带正电的的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度变化率，计算GHb浓度。 

（3）胶乳凝集法：利用抗原抗体反应直接测定总lib中HbAlc的百分含量的方法。样品中总Hb和GHb与胶乳有相同的非特异性吸附而固相化，当加入HbAlc的特异性单克隆抗体后形成胶乳一GHb．鼠抗人GHb单克隆抗体的复合物，此复合物由于羊抗鼠抗体而形成凝集，凝集量因胶乳表面固相化的GHb量的不同而不同。通过测定其吸光度并与GHb百分浓度的标准曲线比较后即可求出样品中GHb所占Hb的百分含量。免疫法测定糖化血红蛋白其准确性和重复性均有欠缺，测定受高浓度葡萄糖、高三酰甘油、高胆红素等物质的干扰，由于样本的浊度会使光度计测定产生错误。另外，抗体由动物免疫获得，成本高且筛选周期长，批与批之间存在差异；抗体对温度湿度敏感，易变性难保存等缺点。 

亲和层析法：利用硼化亲和试验作为检测原理。该法的试剂能溶解红细胞并特异性沉淀血红蛋白因子，其中蓝色的硼酸缀合物能和糖化血红蛋白上的Cis-diols相结合。血液加入试剂中，红细胞立即溶解，使全部的血红蛋白都沉淀，硼酸缀合物就和GHb中的cis-diol结构相结合。血液和试剂混合后加入滤膜装置，所有沉淀的血红蛋白，不管是和缀合物结合的或未结合的都保留在滤膜的顶部。过量的显色缀合物就被洗涤液洗掉。通过金标定量仪测定蓝色（糖化血红蛋白）和红色（总血红蛋白）的强度，可以计算样品中的GHb的百分比。 

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子, 国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX 技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成) 文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程), 并结合体外扩增技术, 经过多轮的循环选择富集, 获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 长度一般为25~60 个核苷酸。