[发明专利]适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法

说明书

技术领域

本发明属农田害虫防控技术领域，具体涉及一种适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法。

背景技术

亚洲玉米螟又称钻心虫，属鳞翅目螟蛾科，是玉米的主要虫害，也为害高粱和谷子等作物。玉米螟可危害玉米植株地上的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量。北方春玉米区因玉米螟为害，一般年份减产10％左右，大发生年减产20％～30％。仅吉林省每年因玉米螟为害损失在5亿公斤以上。

随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代，蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征，要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究，可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心，样品制备和溶解事关2-DE的成效，目标是尽可能提高分辨率。

由于昆虫血淋巴是血液和淋巴液的混合物，在昆虫的开放式循环系统中循环，是昆虫代谢的重要场所，也是代谢过程中各种物质储存和交换的场所，在昆虫的防御、抗冻、免疫、损伤应答等方面起重要作用。昆虫蛋白制备方法较多，但是针对亚洲玉米螟幼虫血浆样品(特别是适于双向电泳分析的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品)的制备方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于双向电泳的具有较高质量的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法。

本发明包括下列步骤：

1．用75％酒精对亚洲玉米螟幼虫进行体表消毒，在-20℃冰冻10min；

2．取出亚洲玉米螟幼虫，在不挤压腹部不破坏消化道的前提下，用无菌剪剪掉幼虫腹足，再用10ul的移液枪吸取透明的血淋巴，在冰上快速将其放入离心管中，快速放入是为防止血淋巴被氧化；

3．将吸取后的亚洲玉米螟放入底部设有小孔的0．5ml的锥形离心管，再将锥形离心管插入1．5ml离心管中，在4℃条件下8000×g离心10min后，从1．5ml离心管底部收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入10mgN-苯基硫脲；

4．将收集好的血淋巴在4℃条件下5000×g离心5min，取上清，按每管20ul分装，每管中加入80ul 50％的PEG，使PEG的终浓度为40％，震荡混匀30s，放冰上冰浴1h；

5．在4℃条件下15000×g离心15min，弃上清，每管沉淀中加入600ul100％的冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min；

6．在4℃条件下15000×g离心15min，弃上清，每管沉淀中加入600ul 80％冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min，在4℃条件下15000×g离心15min，真空离心干燥1min，得到亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白的粗提物；

7．将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化／裂解缓冲液混合，在30℃条件下水浴30min，促进蛋白的溶解，然后在4℃条件下15000×g离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品液。

步骤6和7中所述的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化／裂解缓冲液的质量体积比为100mg／100uL-300mg／100uL。

步骤7中所述的水化／裂解缓冲液为含有5mol／L尿素、2mol／L硫脲、2％CHAPS、20mM二硫苏糖醇、0．002％溴酚蓝和2％IPG缓冲液的溶液。

本发明采用PEG法提取蛋白，避免了血糖、血脂、有机酸、色素等干扰物质对双向电泳的影响。本发明的方法水化／裂解缓冲液中的尿素可以使蛋白质去折叠暴露疏水核心，而配合使用硫脲会增加蛋白质在固定pH梯度(IPG)胶条中的溶解性；二硫苏糖醇还原二硫键，从而使蛋白质达到完全溶解的状态；IPG缓冲液能清除氰酸盐离子、离心时加速核酸沉淀。

本发明的适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品的制备方法快速、简单易行，可获得高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于进行后续生物质谱分析鉴定蛋白的研究，本发明可广泛应用于亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白质组学研究，具有较高的实用价值。

附图说明

图1为亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品的双向电泳图谱

其中：MW为蛋白质分子量标准，单位是kDa。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；实施例中的浓度，如无特别说明，均为体积百分比(V／V)。