[发明专利]适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法

权利要求书

1.一种适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法，其特征在于包括下列步骤：

1)用75％酒精对亚洲玉米螟幼虫进行体表消毒，在-20℃冰冻10min；

2)取出亚洲玉米螟幼虫，在不破坏消化道的前提下，用无菌剪剪掉幼虫腹足，挤压腹部，再用10ul的移液枪吸取透明的血淋巴，在冰上快速将其放入离心管中；

3)将吸取后的亚洲玉米螟放入底部设有小孔的0．5ml的锥形离心管，再将锥形离心管插入1．5ml离心管中，在4℃条件下8000×g离心10min后，从1．5ml离心管底部收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入10mgN-苯基硫脲；

4)将收集好的血淋巴在4℃条件下5000×g离心5min，取上清，按每管20ul分装，每管中加入80ul 50％的PEG，使PEG的终浓度为40％，震荡混匀30s，放冰上冰浴1h；

5)在4℃条件下15000×g离心15min，弃上清，每管沉淀中加入600ul100％的冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min；

6)在4℃条件下15000×g离心15min，弃上清，每管沉淀中加入600ul 80％冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min，在4℃条件下15000×g离心15min，真空离心干燥1min，得到亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白的粗提物；

7)将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化／裂解缓冲液混合，在30℃条件下水浴30min，促进蛋白的溶解，然后在4℃条件下15000×g离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品液。

2.按权利要求1所述的适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法，其特征在于所述的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化／裂解缓冲液的质量体积比为100mg／100uL-300mg／100uL。

3.按权利要求1所述的适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法，其特征在于所述的水化／裂解缓冲液为含有5mol／L尿素、2mol／L硫脲、2％CHAPS、20mM二硫苏糖醇、0．002％溴酚蓝和2％IPG缓冲液的溶液。