[发明专利]ALK融合基因检测的PCR引物、试剂盒和液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及ALK融合基因检测的的PCR引物、试剂盒和液相芯片。

技术背景

ALK基因位于染色体2p23位点，正常情况下人源的alk可转录产生大小6222bp的mRNA，由29个外显子构成，编码1620个氨基酸序列200KDa的I型穿膜蛋白ALK，该蛋白为一种受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK），是RTK胰岛素超家族的成员。完整的ALK具有典型的RTK三部分结构，即胞外区、亲脂性穿膜区和胞浆内酪氨酸激酶。据文献报道，ALK蛋白除在极少部分弥漫性大B细胞淋巴瘤中表达外，可在60%～85%的原发性系统性ALCL中表达，是原发性系统性ALCL相对特异的免疫表型特征。ALK在某些ALCL中的异常表达来源于不同的染色体易位，每个易位会产生不同的融合蛋白质，由配偶体的5’端和ALK酪氨酸激酶结构域3’端融合得到。在大部分ALK融合基因中，ALK断裂点位于第19内含子内，在mRNA上，断裂点一般位于第20个外显子的第一个核苷酸上。

目前，与ALK相关的融合基因，除了发现EML4-ALK融合基因之外，又发现了KIF5B-ALK.、KLC1-ALK和TFG-ALK融合基因。在腺癌患者检测中发现了两种KIF5B-ALK基因融合亚型，K15;DEL15A20和K17;A20。

KLC1-ALK融合基因也许并不多见，但是该融合基因在肺腺癌中确实存在。KLC1与ALK基因发生融合，与ALK基因发生t(2;14)(p23;q32.3)易位产生KLC1-ALK融合基因。这两个基因之间，形成框内基因融合。完整KLC1-ALK cDNA可能产生的具有984个氨基酸的蛋白质，包含KLC1基因三分之二的氨基末端和ALK基因细胞内区域。研究发现，具有这个融合基因的病人极可能受益于ALK抑制剂治疗。另外，KLC1-ALK融合基因从腺癌（原发生位置细支气管肺泡癌）中被发现。而细支气管肺泡癌很少发现KLC1-ALK融合基因，从病理学角度出发，大规模检测细支气管肺泡癌个体以及对ALK融合基因癌前情况，这是非常有意义的。

在非小细胞肺癌（NSCLC）中，Rikova等研究发现了TFG-ALK融合基因，这个融合基因有两种异位的变异型：最近证实为t（2；3）（p23；q35）和inv（2）（p23q25），两种不同的融合蛋白85kDa（TFG-ALK短的）和97kDa（TFG-ALK长的）是与t（2；3）（p23；q25）有关，这种包括TFG（TRF融合基因），inv（2）（p23q25）包括ATIC基因（以前称为pur-T），是转录ATIC，其在嘌呤生物合成通路上起着重要作用。

目前，针对ALK融合基因的研究大部分采用RT-PCR方法以及非放射性同为杂交FISH方法进行检测。RT-PCR方法是针对已知的ALK融合基因的类型以及融合方式来设计引物，将RNA反转录获得cDNA后，通过PCR扩增目的片段的方式来进行检测，则存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。非放射性原位杂交技术FISH法的原理是设计与被检测的ALK融合基因同源互补的核酸探针，二者经过变性－退火－复性，即可形成KALK融合基因的DNA与核酸探针的杂交体。用报告分子（如生物素等）标记核酸探针的某一种核酸，可利用该报告分子与荧光素标记的特异性碱基之间的免疫化学反应，经荧光检测体系的镜下对待测DNA进行定性以及相对定位分析。尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，而且其只能检出融合基因是否存在，不能准确得出具体的融合类型，且灵敏性较低，因而一定程度上限制了该法的应用。鉴于各种融合基因（如ALK融合基因）的表达产物对癌症等疾病的发生发展起着重要作用，因此，本领域迫切需要开发更为实用的融合基因检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测ALK融合基因的PCR引物，所述PCR引物可用于单独或并行检测KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因的5种基因融合亚型：KIF5B-ALK的K15;DEL15A20、K17;A20；KLC1-ALK的K9;A20；TFG-ALK的T6;A20、T3;A20。

实现上述目的的技术方案如下：