[发明专利]一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种麦芽糖孔蛋白编码基因LamB，其特征在于，该基因具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

2.一种重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆；

（2）大肠杆菌表达载体pET32-LamB的构建；

（3）大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB的构建；

（4）重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆：设计简并引物，以弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR，得到麦芽糖孔蛋白编码基因LamB；然后将其连至pMD19-T中，构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-LamB；将该载体转化至DH5α感受态细胞，构建大肠杆菌重组菌DH5α-pMD19-T-LamB，测序；其中简并引物序列如下：

LamB-F:5'-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3'

LamB-R:5'-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3'

其中，S=C/G；N=A/C/G/T；Y=C/T；R=A/G；

（2）大肠杆菌表达载体pET32-LamB的构建：设计表达引物，以克隆载体pMD19-T-LamB为模板，进行PCR,将得到的LamB基因与表达载体pET32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接，构建大肠杆菌表达载体pET32-LamB；其中表达引物序列如下：

LamBeF:5'-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3'

LamBeR:5'-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3'；

（3）大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB的构建：将（2）中的大肠杆菌表达载体pET32-LamB转化BL21感受态细胞，得到大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB；

（4）重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备：在液体LB（含100μg/ml的氨苄青霉素）培养基中按1%比例接入培养过夜的（3）中的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB菌液，在37℃培养至OD600=0.6后加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于37℃温度进行诱导表达6h；收集菌体，纯化包涵体，包涵体纯化液直接过镍NTA琼脂糖凝胶FF柱，亲和层析纯化重组酶，咪唑梯度竞争洗脱，得到纯化的重组麦芽糖孔蛋白LamB。

4.由权利要求2或3所述的方法制备的重组麦芽糖孔蛋白LamB。

5.制备权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌表达载体pET32-LamB。

6.制备权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB。

7.一种弧菌交叉保护性疫苗，其特征在于，该疫苗含有权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB。

8.治疗弧菌病的药物，其特征在于，该药物含有权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB。

9.以权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB为免疫原制备的抗体。

10.含有权利要求9所述抗体的用于检测弧菌病的诊断试剂盒。