[发明专利]虾蟹螺原体病原的原位杂交检测探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种虾蟹螺原体病原的原位杂交检测探针及检测用试剂盒。

背景技术

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，是我国特有的水产养殖珍品，但随着养殖集约化和规模化发展，各种病害已经成为危害养蟹业的重要难题。在河蟹众多疾病中，“颤抖病”最为常见、危害也最严重，该病自1994年首次在江苏被发现后，相继在上海、浙江、安徽、江西等地暴发，并呈逐年加剧趋势，后来几乎蔓延到全国各河蟹养殖地区。2008年农业部已将该病列为新修订的“一二三类动物疫病病种名录”中。克氏原螯虾（Procambarus clarkii），俗称小龙虾，是另一种非常有潜力的淡水养殖品种，江苏、湖北、安徽等地均将其列为重点推荐养殖品种，发展非常迅速，而虾蟹混养则为当前的主要养殖模式之一。研究发现，在暴发“颤抖病”的虾蟹混养的池塘中，伴随着中华绒螯蟹的大量死亡，克氏原螯虾也连续出现大规模死亡，经查明螺原体（spiroplasma）是引起它发病的病原[1]，此外，其他水产养殖甲壳动物如南美白对虾[1]、罗氏沼虾也相继发现了螺原体病原[2]，由此可见，螺原体病原已经成为当前虾蟹重要的新型病原。目前超薄切片电子显微镜观察是使用较多的检测方法，但该方法对操作技术与仪器设备要求较高，且实验周期长，较难普及；PCR也是另一种常用的检测方法[3]，该方法虽然检测较为简单，灵敏度高，但不能直观的观察和证明螺原体的包涵体，而且易于因操作中的模版污染而出现假阳性。原位杂交假阳性率低，从直观性、准确性和灵敏度综合考虑是一种其它任何方法都无法替代的检测方法，但至今未见有关水产螺原体病原的原位杂交检测方法。（参考文献：[1]Wang,W，Gu,W，Ding,Z,et al.A novel Spiroplasma pathogen causing systemic infection in the crayfish Procambarus clarkii (Crustacea:Decapod),in China[J].FEMS microbiology letters,2005,249,131-137;[2]Liang T,Li X,Du Jie,et al.Identification and isolation of a spiroplasma pathogen from diseased freshwater prawns,Macrobrachium rosenbergii,in China:A new freshwater crustacean host.Aquaculture 2011,318:1-6,2011.[3]Ding,Z,Bi,K,Wu,T,et al.A simple PCR method for the detection of pathogenic spiroplasmas in crustaceans and environmental samples[J].Aquaculture,2007,265,49-54.）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于高灵敏度、高可信度同时又非常直观的虾蟹螺原体病原的早期检测的探针，并提供检测试剂盒。

本发明根据螺原体在细菌分类学上具有保守功能的16S rDNA序列中的两段特有的DNA序列设计合成了两条寡核苷酸探针，建立了螺原体病原的原位杂交检测方法，该探针与健康克氏原螯虾及患白斑综合征病毒病（WSSV）的克氏原螯虾样品均无特异性信号，而与螺原体感染阳性样品有明显的深棕色信号，具有很好的特异性，且能直观地将检测到的病原螺原体与其引起的病理变化结合起来，从而确定该病原的感染部位、感染程度，了解其致病力。该方法具有优异的直观性、准确度和灵敏度，实现了本发明的目的。

本发明所述的两条螺原体病原的原位杂交检测探针，其序列如下

（1）5'-GTTCTTCCCTTACAACAGACCTTTACAATCCGA-3'（SEQ ID NO.1）

（2）5'-GTACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACTAGGGT-3'（SEQ ID NO.2）。

本发明提供了一种虾蟹病原螺原体的原位杂交检测方法，其技术方案包括如下步骤：

（1）用地高辛标记的特异的探针与组织切片中螺原体16S rDNA杂交结合；

（2）进行原位杂交检测：

a.所述的地高辛标记的探针结合生物素化鼠抗地高辛，再结合链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，最后再结合生物素化过氧化物酶；

b.经酶反应显色；